Статус Проект Порядок розслідування, обліку і проведення лабораторних досліджень у випадках харчових отруєнь. Інструкція

Чутливий до всіх коліцинів колекції Фредеріка

Е.coli φ

Не чутливий до S₁ і S₄

Е.coli B

Не чутливий до коліцинів F,S₁ і S₅

Коліцинотипування, як і коліциногенотипування, засновано на використанні феномена відстроченого антагонізму, що виявляється методом перехресних посівів, який описаний у розділі “коліциногенотипування” з тією тільки різницею, що спочатку смужкою наносять відому еталонну коліциногенну культуру, а через 48 годин паралельними штрихами перпендикулярно еталонній підсівають 18-годинні бульйонні досліджувані культури, або методом агарових шарів, опис якого наведений нижче.

Перший день Еталонні культури з колекції Фредеріка пересівають на м’ясо-пептонний бульйон і поміщають у термостат на 18 – 20 годин при (37±1) ºС.

Агар Хоттингера з генціанвіолетом, як зазначено вище в розділі “коліциногенотипування”, розливають у чашки Петрі, кількість яких перевищує число досліджуваних культур у два рази.

Другий день М
аркують чашки з агаром для посіву еталонних культур. На першій чашці для 8 культур, на 2-ій – для 7 культур. Підписують на кожній чашці тільки одну культуру, від якої стрілкою вказують напрямок і порядок посіву, по периметру чашки ставлять крапки, що відповідають кількості і місцю посіву наступних культур (мал.4).

1) Са – 7, Са 18, також Са 23, Са 31, Са 38, Са 42, Са 46, Са 53.

2) Са 58, Са 62, К- 2351, Р_1, Р_9, Р_14, Р_15. Наносити всі 15 культур на одну чашку не рекомендується, тому що S.sonnei мають множинну чутливість до коліцинів і облік результатів досліду буде ускладнений. Еталонні 18-годинні бульйонні культури наносять уколом в агар відповідно маркуванню чашки, і посіви інкубують при (37±1) ºС 48 годин.

Третій день Досліджувані культури засівають у м’ясо-пептонний бульйон і витримують при (37±1) ºС протягом 18 – 20 годин.

Четвертий день Чашки з посівами еталонних культур, що виросли у вигляді макроколоній – бляшок, виймають з термостата. Посіви обробляють за звичайною методикою 1–1,5 години у парах хлороформу. До розплавленого й охолодженого до 45ºС 0,2% агару (по 5-6 см³ у пробірці) додають 4-5 краплі бульйонної досліджуваної культури і виливають по 2,5-3 см³ у кожну з 2-х чашок з макроколоніями еталонних культур. Чашки інкубують 18 – 20 годин при (37±1) ºС.

П'ятий день О
блік результатів типування проводять по зонах пригнічення росту досліджуваних культур. Навколо макроколоній (мал. 5) розмір зони визначають міліметрівкою від краю колонії до початку росту досліджуваної культури. Зони, розмір яких менш 1,5 – 2 мм не враховують, тому що при повторних типуваннях досліджуваної культури чутливість до даного коліцину може бути цілком відсутня. Затримку росту відзначають плюсами: зона 2-4 мм ++, зона 5-10 мм +++, зона понад 10 мм ++++.

Результати типування заносять у реєстраційний журнал у вигляді спектра чутливості до еталонних коліцинів (таблиця 6).

Таблиця 6

Схема реєстрації результатів коліцинотипування культур у робочому журналі

№№ культур

Назва культур

Чутливість

112

S.sonnei

B, D, F, S₅

418

S.sonnei

B, F, Е +J, К

Додаток13 Рецептура деяких поживних середовищ і спосіб їх приготування

1. Загальні вимоги

1.1. Загальні вимоги до приготування поживних середовищ (ПС) згідно ГОСТ 10444.1-84. “Консервы. Приготовление растворов, реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе”

1.2. Контроль якості ПС здійснюють згідно ІЛ ЦСЕС МОЗ України №05.4.1/1670 від 15.11.2000 року “Бактеріологічний контроль поживних середовищ”.

1.3. Кожне приготування ПС і результати контролю якості реєструють в журналі за ф. 256/О “Журнал приготування та контролю поживних середовищ”.

2. Консерванти

Гліцеринова суміш:

Склад:

Натрію хлорид (NaCl) 0,85% розчин

Гліцерин нейтральний Натрію гідрофосфат безводний (Na₂HPO₄) 20% розчин – 1000 см³

– 500 см³

– 150 см³

Приготування: змішують перших два інгредієнти і додають розчин натрію гідрофосфата у такій кількості, щоб довести рН до 7,8 – 8,0, розливають у пробірки або флакони по 10 см³, стерилізують в автоклаві при (1121) ºС протягом 15 хв. або текучою парою 3 дні підряд. Після стерилізації рН 7,8 – 7,8. Фосфатно-буферна суміш:

Склад:

Калію дигідрофосфат (KH₂PO₄)

Натрію гідрофосфат безводний (Na₂HPO₄)

Вода дистильована

– 0,45 г

– 5,34 г

– 1000 см³

Приготування: Інгредієнти змішують, розливають по 10 см³ в пробірки або флакони, стерилізують в автоклаві при (1201) ºС 30 хв. Буферна гліцерино-сольова суміш:

Склад:

Натрію хлорид (NaCl)

Калію гідрофосфат (KHPO₄)

Калію дигідрофосфат (KH₂PO₄)

Гліцерин нейтральний Вода дистильована

– 4,2 г

– 3,1 г

– 1 г

– 300 см³

– 700 см³

Приготування: інгредієнти розчиняють, перемішують, суміш розливають в стерильні пробірки по 5 см³, автоклавують при (1121) ºС 30 хв. Рекомендують з метою кращого перегляду розчин слабко підфарбовувати феноловим червоним. Розчини для приготування розведень

0,1% пептонна вода:

Склад:

Натрію хлорид (NaCl)

Пептон

Вода дистильована

– ,5 г

– 1 г

– 1000 см³

Приготування: натрію хлорид та пептон розчиняють у дистильованій воді при повільному нагріванні. Отриманий розчин, при необхідності, фільтрують через паперовий фільтр, встановлюють рН 7,0 0,1, розливають в колби, пробірки або інший посуд, закривають і стерилізують при (1211) ºС протягом 30 хв. Середовища збагачення та для первинного посіву

Сухі середовища Плоскірева, Ендо, вісмут-сульфіт агар, Олькеніцкого, Кліглера, селенітовий бульйон Лейфсона, магнієве середовище промислового виготовлення готують за прописом, зазначеним на етикетці. Середовище Раппопорт

Склад:

М’ясо-пептонний бульйон

– 900 cм³

Стерильна бичача жовч

– 100 cм³

Глюкоза

– 20 г

Розчин індикатора Андреде

– 10 cм³

Приготування: інгредієнти змішують, розливають у флакони з поплавками по 50 cм³. Стерилізують автоклавуванням при (1121) ºС 20 хв. 6,5%, 10% сольовий та 1% цукровий бульйони

Склад:

М’ясо-пептонний бульйон

– 100 cм³

Натрію хлорид або (глюкоза)

– 6,5 (10)г або 1 г

Приготування: сіль або глюкозу розчиняють у м’ясо-пептонному бульйоні, встановлюють рН таким чином щоб після стерилізації рН становило 6,90,1. Бульйон розливають у колби або пробірки і стерилізують при (1211) ºС протягом 15 хв.

1% пептонна вода з 3% NaCl

Склад:

Пептон

– 10,0 г

Хлористий натрій

– 30,0 г

Азотнокислий калій

– 0,1 г

Вуглекислий натрій

– 2,5 г

Дистильована вода

– 1000 см³

рН 8,4-8,6

1% пептонна вода з 7% та 10% NaCl має ідентичний склад, але вміст NaCl збільшується до 70,0 г та 100,0 г відповідно.

1% пептонна вода без NaCl повинна вміщувати тільки воду та пептон. При її виготовленні підлужування проводять дуже обережно, так як у випадку додавання надлишкової кількості їдкого натру нейтралізація його соляною кислотою приведе до утворення NaCl і середовище буде непридатним для визначення галофільності.

Пептонну воду без NaCl не готують з основного розчину пептону, так як в ньому вже є хлористий натрій.

Сухий лужний агар

Склад:

Пептон ферментативний

– 22,0 г

Екстракт дріжджів

– 0,5 г

Натрію хлорид

– 12,3 г

Натрію метабісульфіт

– 1,0 г

Натрію карбонат

– 1,5 г

Натрію фосфат двозаміщений

– 1,5 г

Агар

– 11,3 г

Дистильована вода

– 1000 см³

рН 7,80,2

Приготування: наважку сухого препарату ретельно розмішують при нагріванні в 1000 см³ дистильованої води, кип’ятять протягом 2 – 3 хвилин до повного розплавлення агару, відстоюють протягом 30 хвилин, при необхідності фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають у стерильні флакони, стерилізують насиченою парою при (1211) ^º С протягом 20 хвилин у паровому стерилізаторі.

Середовище Вагатцума

Склад:

Пептон

– 10,0 г

Дріжджовий екстракт сухий

– 3,0 г

Хлористий натрій

– 70,0 г

Двозаміщений фосфорнокислий калій

– 5,0 г

Агар-агар

– 150,0 г

Дистильована вода

– 1000 см³

Приготування: перераховані інгредієнти розчинюють при нагріванні, але не стерилізують. Потім додають 1,0 г маніту, 0,1 см³ 0,1% спиртового розчину кристалвіолету та 5,0 см³ дефібринованої крові людини. Середовище розливають в чашки, після застигання підсушують і використовують за призначенням.

Середовище Нікодемуса

Склад:

Стерильній 2% поживний агар

– 1000 см³

Етанол

– 80 см³

Емульсія двох жовтків

Приготування: до розплавленого і охолодженого до 45-50 ºС агару додають етиловий спирт і ,після перемішування, емульсію яєчних жовтків. Ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі, які можна зберігати у холодильнику не більше 3 діб.

Емульсію яєчних жовтків готують шляхом емульгування відділених від білка 2 жовтків в 10 см³ стерильного фізіологічного розчину.

Сольовий-поліміксиновий агар з 2,3,5-трифеніл-тетразолій хлоридом (ТТХ)

Склад:

Стерильний 2% поживний агар

– 1000 см³

Хлорид натрію (NaCl)

– 60 г

Поліміксин «М»

– 200000 – 400000 од

2,3,5-трифеніл-тетразолій хлорид

– 0,1 – 0,2 г

Емульсія двох жовтків

Приготування: в агар після розплавлення і охолодження до 45-50 ºС додають поліміксин, 2,3,5-ТТХ та емульсію жовтків, ретельно перемішують і розливають в чашки Петрі, які можна зберігати у холодильнику не більше 7 – 10 діб.

Кров’яний агар

Склад:

Стерильний 2% поживний агар

– 1000 см³

Кров дефібринована

– 5 см³

Приготування: до розплавленого і охолодженого поживного агару додають кров, ретельно перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі.

Середовища для попередньої диференціації

Трицукровий агар з сечовиною (Олькеніцького)

Склад:

Дистильована вода

– 1000 cм³

Сухій поживний агар

– 25 г

Лактоза

– 10 г

Сахароза

– 10 г

Глюкоза

– 1 г

Сечовина

– 10 г

Амоній-залізо (ІІ) сульфат (FeSO₄·(NH₄)₂ ·6Н₂О)

– 0,2 г

Натрій тіосульфат(Na₂S₂O₃·5Н₂О)

– 0,3 г

0,4% водній розчин фенол-рот

– 4 см³

Приготування: солі попередньо розчиняють в невеликій кількості дистильованої води. Вуглеводи і сечовину розчиняють так само, але підігріваючи на водяній бані. Сухий поживний агар розплавляють в решті води підігріваючи на вогні та помішуючи. Усі інгредієнти ретельно з’єднують, змішують з розплавленим агаром, фільтрують через марлевий фільтр, встановлюють рН 7,2–7,4. Додають індикатор, добре перемішують, розливають у пробірки по 6-7 см³. Стерилізують при (1121) ^ºС 15 хв. Після стерилізації середовище скошують. При скошуванні залишають в нижній частині пробірки нескошений стовпчик висотою біля 2 – 2,5 см. Готове середовище має блідо-рожевий колір.