Умовні позначення:

+ – ферментація середовища

- – середовище не ферментується

+,-– середовище ферментується, деякими варіантами не ферментується

-,+ – середовище не ферментується, деякими варіантами ферментується

Х – варіанти стосовно даної ознаки

10.2. Бактеріологічні дослідження

Перший день

Для прискореної діагностики з об'єктів довкілля (вода, змиви, харчові продукти і т. ін.), при можливості, застосовують метод імунофлюоресценції. Для перегляду препаратів використовують люмінесцентні мікроскопи. Колір світіння залежить від кольору люмінесцентного барвника, що застосовується для мітки сироватки. У випадку позитивної реакції на темному тлі препарату видно клітини характерної морфології, що світяться по периферії. Оцінка результатів проб безпосередньо з об'єктів довкілля з метою виявлення збудників дизентерії повинна бути дуже обережною. Використання люмінесцентних дизентерійних сироваток до S.flexneri і S.sonnei дозволяють одержати відповідь, що має лише сигнальне, орієнтовне значення. Основна причина цього – існування спільності антигенної структури серед непатогенних видів бактерій і, зокрема, кишкової палички з бактеріями роду Shigella, що приводить до хибно позитивного фарбування супутньої мікрофлори.

Остаточний висновок може бути видано тільки на підставі виділення з досліджуваного матеріалу збудника і його подальшої ідентифікації.

Другий день

Після інкубації переглядають чашки з посівами і лактозонегативні колонії відсівають на середовище Олькеніцького (Кліглера) та на скошений м’ясо-пептонний агар. Із жовчного бульйону (селенітового середовища) роблять висів на середовище Плоскірева та Ендо. Усі посіви інкубують при (37±1) ºС 18 – 20 годин.

Третій день

Переглядають чашки з висівами із середовища збагачення і відсівають лактозонегативні колонії на середовище Олькеніцького (Кліглера) і скошений м’ясо-пептонний агар та інкубують при (37±1) ºС 18-20 годин

Проводять попередню ідентифікацію виділених напередодні культур по біохімічним і серологічним властивостям у реакції аглютинації на склі з адсорбованими сироватками.

Для подальшого вивчення відбирають культури грамнегативних безспорових паличок з характерними властивостями для шигел, а саме: не розщеплюють лактозу і сечовину, не утворюють сірководень, ферментують глюкозу з утворенням кислоти і без газу. Варто враховувати, що серед S.sonnei зустрічаються біохімічні варіанти, що ферментують лактозу до кислоти, а деякі варіанти S.flexneri VI розщеплюють глюкозу до кислоти і газу.

Для остаточної ідентифікації досліджувані культури засівають на мінімальний диференційний ряд (таблиця 1). Для прискорення досліджень, отримання відтворюваних результатів доцільно для біохімічної ідентифікації використовувати діагностичні системи та набори, що зареєстровані в Україні, типу ЕНТЕРОтест (PLIVA-Lachema),АРІ (bioMereux).

Культури, підозрілі як шигели, досліджують у реакції аглютинації на склі спочатку із полівалентною сироваткою до S.flexneri I-VI, sonnei, а у випадку негативної реакції – з набором полівалентних сироваток до S.boydii, S.dysenteriae. При позитивній реакції аглютинації на склі однієї з полівалентних сироваток продовжують серологічну ідентифікацію культури з адсорбованими сироватками, що входять у полівалентну. У випадку позитивної реакції з полівалентною сироваткою до S.flexneri I-VI sonnei, проводять аглютинацію з полівалентною сироваткою до S.flexneri I-VI та S.sonnei. Якщо аглютинація відбулась із сироваткою S.flexneri I-VI, то далі необхідно визначити серовар і підсеровар S.flexneri (таблиця 9) у реакції аглютинації на склі з типовими і груповими сироватками. При позитивному результаті аглютинацій з монорецепторними сироватками можна видати попередню відповідь про наявність у досліджуваному матеріалі шигел.

Четвертий день

Проводять остаточну ідентифікацію культур за біохімічними властивостями (табл. 1, 9), встановлюють антигенну формулу за допомогою повторної реакції аглютинації на склі культур, знятих зі скошеного агару і видають остаточну відповідь про наявність або відсутність в досліджуваному матеріалі шигел.

При ідентифікації виділених культур можуть виникнути наступні ускладнення:

  1. Виділення культур шигел із відхиленнями від типової характеристики по ферментативній активності. Наприклад, зустрічаються манітнегативні варіанти S.flexneri і S.sonnei, манітферментуючі різновиди S.dysenteriae, ксилозоферментуючі варіанти підвиду S.flexneri; лактозоферментуючі варіанти S.boydii.
  2. Виділення інаглютинабельних культур.
  • через наявність поверхневого антигену К. У цьому випадку прогрівання культури протягом 1-1,5 годин при 100 ºС руйнує термолабільний К-антиген і аглютинація з О-сироваткою відновлюється;
  • через втрату типоспецифічного антигену S.flexneri. Селекціонування окремих колоній з поживного агару, що володіють повним антигенним комплексом, дозволяє з'ясувати дійсний серовар культури.
  1. Виділення атипових представників родини Enterobacteriaceae, що виявляють подібність за біохімічними і серологічними властивостями із шигелами. Диференційні біохімічні ознаки деяких представників родів родини Enterobacteriaceae, що найбільш часто зустрічаються, котрі можуть допомогти при їх ідентифікації, представлені в таблиці 1.

Додатково доцільно досліджувати чутливість виділених культур до полівалентного дизентерійного бактеріофагу. Для цього використовують наступну методику: на добре підсушену чашку зі слабко лужним агаром (рН 7,6) наносять пастерівською піпеткою краплю змиву 18-20-годинної агарової культури. На підсохлі краплі відтягнутою пастерівською піпеткою наносять дизентерійний бактеріофаг; після підсушування чашки інкубують при (37??1) ºС протягом 18-20 годин. При позитивному результаті спостерігається затримка росту культури на чашках з бактеріофагом.

У складних випадках при ідентифікації бактерій родини Enterobacteriaceae рекомендується застосовувати кератокон’юктивальну пробу на морських свинках. При постановці проби повну петлю (діаметром ) добової агарової культури вносять у кон’юнктивальний мішок ока морської свинки під нижнє віко. Переважна більшість свежовиділених шигел викликає в морських свинок специфічний кератокон’юнктивіт на 2 – 5 добу: кон’юнктива гіперемована, роговиця мутна, набрякла, з білуватим відтінком, рясні гнійні виділення.

Крім шигел кератокон’юнктивіт можуть викликати патогенні кишкові палички серотипу 0124:К17 і дуже рідко деякі сальмонели (наприклад – S.typhimurium), але ці ентеробактерії легко диференціюються від шигел за їх біохімічними властивостям.

Для видачі остаточної відповіді, що підтверджує не тільки виділення шигел із досліджуваного матеріалу, але і загальне джерело зараження і шляхи передачі інфекції, потрібно більш поглиблене вивчання виділених штамів з використанням методів внутрішньовидового типування. Для цього виділені культури шигел піддають більш детальному біохімічному вивченню, що дозволяє здійснити подальшу диференціацію збудника усередині серологічних типів і, крім того, використовують методи, засновані на феномені коліциногенії, також визначення антибіотикограм.

Для визначення біохімічних варіантів застосовують вуглеводи, що дозволяють підрозділити серовари на “+” варіанти (що ферментують за 24 години) і “-“ варіанти (що не ферментують) (таблиці 10, 11, 12, 13, 14).

Таблиця 10

Схема визначення біоварів S.flexneri 1-5, var.X,Y

(Н.А. Хоменко, Б.С. Кисельова , 1967)

Біовар

Ферментація вуглеводів

мальтоза

арабіноза

сорбіт

рамноза

1

+,(+)

+,(+)

+,(+)

+,(+)

2

+,(+)

+,(+)

+,(+)

-

3

+,(+)

-

+,(+)

+,(+)

4

+,(+)

-

-

-

5

+,(+)

-

+,(+)

-

6

+,(+)

+,(+)

-

-

7

+,(+)

+,(+)

-

+

8

-

+,(+)

+,(+)

+,(+)

9

-

-

+,(+)

+,(+)

10

-

+,(+)

+,(+)

-

11

-

-

+,(+)

-

12

-

+,(+)

-

-

13

-

+

-

(+)

14

-

-

-

(+)

15

-

-

-

-

Умовні позначення:

+ – ферментація через 24 години

(+) – уповільнена ферментація

+,(+)– ферментація частіше у 1-у добу, рідше пізніше

- – відсутність ферментації

S.flexneri VI в залежності від характеру ферментації глюкози, маніта і дульцита поділяються на 7 біоварів (таблиця 11).

Таблиця 11

Схема визначення біоварів S.flexneri VI

(Edwards P., Ewing W., 1972)

Біовари

Ферментація вуглеводів

глюкоза

маніт

дульцит

Boyd 88

+

+

-

Boyd 88

+

+

(+)

Manchester

(+г)

Manchester

-

Newcastl

-

(+г)

Newcastl

+

-

-

Newcastl

+

-

(+)

Умовні позначення:

+ – ферментація на першу добу до кислоти

г – газоутворення

(+)– пізня ферментація

- – ферментація відсутня

Ю.П. Солодовніков із співавторами, на основі схеми K. Bojlen (1934) з використанням ксилози, рамнози і мальтози, у 1971 запропонували поліпшену схему типування S.sonnei, що дозволяє підрозділити їх на 7 біохімічних типів. Для позначення окремих біохімічних типів використовують два види знаків: римські цифри І, ІІ, ІІІ, ІV і латинські букви a, b, c, g, e, d, f.

Таблиця 12

Схема визначення біоварів S.sonnei (Ю.П. Солодовніков, 1971)

Біовар

Ферментація вуглеводів

рамноза

ксилоза

мальтоза

Іа

+(1)

-

+(1-2)

Іb

+(1)

-

+(??2)

ІІg

+(??1)

-

+(1-2)

ІІe

+(??1)

-

+(??2)

ІIId

+(1)

+(1)

+(1-2)

IIIc

+(1)

+(1)

+(??2)

IVf

+(1)

+(2 і пізніше)

+(1 і пізніше)

Умовні позначення:

+ – ферментація (у дужках вказані терміни ферментації);

- – відсутність ферментації

У зв’язку з тим, що частка штамів S.sonnei, не вкладались в схему типування за Ю.П. Солодовніковим, у 1988 році в Україні була рекомендована інша схема (таблиця 14) внутрішньовидового типування S.sonnei. Вона вміщує 12 біоварів і тривалість дослідження 3 доби.

Таблиця 13

Схема визначення біоварів S.sonnei (ІЕІХ)

Біовар

Ферментація вуглеводів

рамноза

ксилоза

мальтоза

Іа

+

-

+(1-2)

Іb

+

-

+(3)

Im

+

-

-

ІІe

+(2-3)

-

+(1-2)

ІІg

+(2-3)

-

+(3)

ІІl

-

-

-

ІІk

-

-

+(1-3)

ІIId

+

+

+(1-2)

IIIc

+

+

+(3)

IVf

+

+(2-3)

+(3)

Vn

-

+(1-3)

-

Vu

-

+(1-3)

+(1-3)

Умовні позначення:

+ – ферментація (у дужках вказані терміни ферментації)

- – відсутність ферментації

Таблиця 14

Схема визначення біоварів S.boydii

(Stypulkowska-Misiurewicz H., Noworyta J., 1973)

Біовар

Ферментація вуглеводів

сорбіт

гліцерин

ксилоза

дульцит

1

+

+

+

+

2

+

+

-

+

3

+

+

+

-

4

-

+

-

-

5

+

+

-

-

6

-

+

-

+

7

+

-

-

+

8

-

+

+

+