Статус Проект Порядок розслідування, обліку і проведення лабораторних досліджень у випадках харчових отруєнь. Інструкція

Для постановки РН готують суміш з рівних обсягів моновалентних сироваток типів A, B, C, E, F. Сироватки кожного типу набирають різними піпетками.

До 1 см³ суміші сироваток A, B, C, E, F додають 4 см³ досліджуваного матеріалу, витримують при кімнатній температурі не менше 30 хвилин, після чого по 1 см³ суміші вводять чотирьом мишам внутрішньочеревно або підшкірно. Чотирьом контрольним мишам вводять по 0,8 см³ досліджуваного матеріалу без сироватки.

Реакцію можна проводити також на 2-х морських свинках. Першій вводять внутрішньочеревно або підшкірно по 0,5 см³ суміші сироваток та 3 см³ досліджуваного матеріалу, витриманого при кімнатній температурі не менше 30 хвилин. Контрольній свинці вводять 3 см³ досліджуваного матеріалу без сироватки.

Спостерігають за тваринами протягом 4 днів. Якщо тварини, що отримали досліджуваний матеріал без сироватки за цей час гинуть, а ті що отримали досліджуваний матеріал з сироваткою залишаються живими, це вказує на присутність ботулінічного токсину в досліджуваному матеріалі. Орієнтовна відповідь може бути видана на другу добу.

Для визначення типу токсину у 6 пробірок розливають по 2,4 см³ досліджуваного матеріалу, потім в кожну пробірку додають 0,6 см³ сироватки. В першу – типу А, другу – типу В, в третю – типу С, четверту – типу Е, п’яту – типу F, в шосту вносять 0,6 см³ 0,9% розчину хлористого натрію. Вміст пробірок перемішують і залишають при кімнатній температурі на 30 хвилин, після чого вміст кожної пробірки вводять по 1,0 см³ двом білим мишам. Для кожної сироватки використовують окремий шприц.

Для більш швидкої ідентифікації типу токсину РН з досліджуваним матеріалом ставлять одночасно з сумішшю і окремими типоспеціфічними сироватками.

Облік результатів проводять попередньо через 4-6 годин, через 24 години і остаточно через 4 дня.

Ботулінічний токсин не дає миттєвої загибелі тварин (протягом декількох хвилин або секунд), миші гинуть не раніше, ніж через 4 – 5 годин.

Звичайно картина хвороби і загибелі мишей дуже характерна: з'являється хекання, стан повного розслаблення м'язів, западання черевної стінки (“осина талія”), паралічі і судоми перед смертю.

Миші, що отримали суміш гомологічного токсину і сироватки, залишаються живими при загибелі усіх інших мишей. Якщо досліджуваний матеріал нейтралізується одночасно сироватками Е та F, що пов’язано з наявністю спільних антигенів, додатково ставлять реакцію нейтралізації з сироватками, розведеними у 40 разів. При цьому нейтралізується лише гомологічний токсин.

Особливу увагу потрібно звернути на постановку РН із сироваткою хворого, тому що її звичайно буває мало. Варто ретельно відокремити сироватку від згустку крові, який необхідно посіяти, тому що при ботулізмі можна знайти в крові паличку ботулізму, а із сироваткою поставити РН. У цьому випадку, слід відразу поставити розгорнуту РН з моновалентними ботулінічними сироватками тільки типів А, В, Е, тому що інші типи ботулінічних паличок зустрічаються дуже рідко.

№№ пробірок

Досліджу-ваний матеріал (в см³)

Ботулінічні сироватки (в см³)

Фізіологіч-ний розчин (в см³)

тип А

тип В

тип С

тип Е

тип F

1 пробірка

2,4

0,6

–

–

–

–

–

2 пробірка

2,4

–

0,6

–

–

–

–

3 пробірка

2,4

–

–

0,6

–

–

–

4 пробірка

2,4

–

–

–

0,6

–

–

5 пробірка

2,4

–

–

–

–

0,6

–

6 пробірка

2,4

–

–

–

–

–

0,6

При одержанні позитивного результату РН з діагностичними ботулінічними сироватками дають висновок про наявність у досліджуваному матеріалі ботулінічного токсину і вказують його тип.

У випадку загибелі всіх 4-х мишей, тобто тих, котрим був уведений досліджуваний матеріал без сироватки і із сироваткою, варто повторити РН з екстрактами, розведеними в 5, 10, 20 і навіть 100 разів для зменшення неспецифічної токсичності сторонньої мікрофлори, що звичайно присутня в блювотних масах, випорожненнях, органах трупів. При розведенні екстрактів стороння мікрофлора втрачає здатність убивати мишей, а ботулінічні токсини, володіючи звичайно більшою біологічною активністю, будуть викликати загибель мишей навіть при розведенні. Тому в кращому випадку відповідь про наявність токсину в пробі може бути даний на 2 – 3 день, а про його типову належність на 3 – 5 день від початку дослідження.

18.2.2. Виявлення збудників ботулізму

Перший день Для виявлення збудників ботулізму роблять посів 3 – 5 см³ з попередньо підготовленого матеріалу на рідкі поживні середовища. Для первинних посівів краще використовувати середовище Вільсон-Блера або Кітт-Тароцці. Необхідно, щоб рН був у межах 7,2 – 7,4. Обов'язковим є також наявність у м'ясних середовищах м'ясного або печінкового фаршу. Пробірка або флакон мають бути заповнені поживним середовищем не менш ніж наполовину. Перед посівом середовища нагрівають на киплячій водяній бані протягом 20 хвилин, після чого швидко прохолоджують, додають 0,5% глюкози і роблять посів.

Посіви здійснюють в середовища у великих пробірках або у флаконах ємністю по 100 – 200 см³, залиті шаром вазелінової олії товщиною в 0,5 см. Краще засівати досліджуваний матеріал у великий об’єм середовища (70,0 – 150 см³), щоб культуральної рідини первинного посіву вистачило на всі дослідження (постановка реакції з полівалентною сироваткою і розгорнутої РН, нерідко з двох- або триразовим повторенням). Наступні пересіви досліджуваних проб з первинного посіву в ті ж рідкі поживні середовища можуть не дати токсиноутворення в середовищі, очевидно, через бурхливий ріст сторонньої мікрофлори.

Посів проводять в чотири флакони, один із яких прогрівають після посіву при 60 ºС 15 хвилин. У умовах прогрівання звичайно гинуть аероби і вегетативні форми анаеробів, але зберігаються спори C.вotulinum типу Е, що гинуть при 80 ºС; інший флакон прогрівають при 80 ºС 20 хвилин. Два флакони після посіву не прогрівають. Після цього усі флакони поміщають у термостат: один непрогрітий флакон і флакон, прогрітий при 60 ºС, інкубують при 28 ºС, інший непрогрітий флакон і флакон, прогрітий при 80 ºС, інкубують при 35 ºС. Перші два флакони досліджують на C.вotulinum, типів Е і F, інші два флакони на C. вotulinum типів А, В, С.

Якщо в досліджуваному матеріалі збудники ботулізму знаходяться переважно у вегетативній формі, то ріст у посівах буде, головним чином, у непрогрітих флаконах. У випадку, якщо в матеріалі є спорові форми, ріст буде в прогрітих флаконах і в окремих випадках може відразу привести до виділення чистої культури з такого посіву. Ріст C.вotulinum, характеризується нерідко сильним газоутворенням і іноді протеолізом шматочків печінки або фаршу.

Залишки проб після посіву зберігають у холодильнику до закінчення дослідження.

Через 48 годин після появи росту посіви досліджуються на наявність збудників ботулізму.

В даний час є повідомлення закордонних учених про те, що для виявлення C.вotulinum типу Е в середовище перед посівом варто додавати трипсин до кінцевої концентрації 0,1%.

Оскільки для таких досліджень потрібно трипсин у досить великих кількостях, його можна замінити еквівалентною кількістю панкреатину. Крім того, такі середовища можна брати в пробірках з об’ємом середовища 15 – 20 см³. Трипсин готують у вигляді 1% розчину, стерилізують шляхом фільтрації через азбестові пластини фільтра Зейтца, і додають з розрахунку 1 см³ 1% розчину трипсину на 10 см³ середовища у флакони, що будуть інкубуватися при (28±1) ºС. У флакони, що попередньо прогрівалися, трипсин додасться після прогрівання.

Третій день Через 48 годин від початку росту з усіх флаконів з дотриманням стерильності беруть проби культуральної рідини (по 10 – 15 см³) і піддають їх дослідженню. Попередньо готують мазки, фарбують їх за Грамом і мікроскопують.

З культуральною рідиною ставлять РН з сумішшю ботулінічних сироваток типів А, В, С, Е, F, як це описано для визначення токсинів. При одержанні позитивних результатів РН ставлять з кожною сироваткою окремо.

При виявленні в досліджуваному посіві паличок, типових по морфології для C.вotulinum, а також ботулінічного токсину дають висновок про зараженість досліджуваного матеріалу збудником ботулізму і наявності в ньому ботулотоксину. Виділення чистої культури в такому випадку не є обов'язковим.

Якщо в посівах виявляють мікроби, морфологічно подібні з C.вotulinum, а токсин відсутній, то слід перед постановкою РН провести активацію культуральної рідини панкреатином або трипсином для виявлення ботулінічних токсинів типу Е, непротеолитичних штамів типу В і деяких штамів типу F, а також провести виділення і вивчення чистих культур. Активацію культуральної рідини перед постановкою РН з протиботулінічними сироватками проводять тільки в тому випадку, якщо в середовище перед посівом не був доданий трипсин або панкреатин, як це рекомендовано вище.

Якщо через 48 годин у флаконах не виявлено росту, то необхідно продовжити інкубацію посівів у термостаті, а дослідження провести знову на 4 – 6 – 10 добу. Якщо дослідження, проведені на 10 добу, не дали позитивних результатів по виявленню C.вotulinum і їх токсинів, то видають відповідь про відсутність C.вotulinum і їх токсинів у досліджуваних матеріалах.

Для виділення чистих культур C.вotulinum застосовують прозорий 1% або 1,5% агар із глюкозою, приготовлений на мартенівському бульйоні або бульйоні Хоттингера, розлитий у пробірки діаметром 0,8 см і довжиною 15-18 см. Перед посівом агар розплавляють і прохолоджують до 45 – 50 ºС. Посів на високий стовпчик роблять у такий спосіб: не відламуючи кінця пастеровської піпетки, занурюють її в досліджуваний матеріал (частіше це первинний посів досліджуваного матеріалу) і переносять послідовно з пробірки в пробірку, ретельно перемішуючи, після чого агар перемішується ще раз шляхом перекочування пробірок між двома долонями. Охолоджені пробірки з посівом інкубують при температурі 35 – 37 ºС. На кожен посів варто брати 5 – 8 пробірок стовпчика агару. Якщо в первинній культурі ріст не дуже рясний, при пересіванні на високий стовпчик пастерівську піпетку варто обламати і набрати небагато культури в капіляр, а потім проводити посів, як зазначено вище.

Якщо в первинному посіві відмічено масивний ріст сторонньої мікрофлори і мало типових ботулінічних паличок із спорами, необхідно взяти 5 – 10 см³ культури в пробірку і піддати її прогріванню на водяній бані при 80 ºС 20 хвилин. Після цього культуру треба знову посіяти на високий стовпчик агару.

Через 1 – 2 доби в останніх пробірках з'являються окремі колонії у вигляді грудочок вати, пушинок з ущільненим центром чи правильних дисків, чечевичок. Підозрілі колонії перевивають на рідке або напіврідке поживне середовище у пробірках з 0,5% глюкози під шаром вазелінової олії. Одночасно частину колонії, що залишилася, мікроскопують.

Пересів колоній з пробірок можна робити двома способами:

1. Стовпчик агару проколюють зверху відламаним капіляром пастерівської піпетки і витягають потрібну колонію.

2. Дно пробірки з високим стовпчиком агару злегка підігрівають на полум'ї пальника; під дією пару закипілої рідини агар виштовхується в стерильну чашку Петрі. Підозрілу колонію витягають відламаним капіляром пастерівської піпетки.

Культуру, що виросла з колонії в рідкому середовищі, мікроскопують і перевіряють на наявність токсину за допомогою реакції нейтралізації на мишах.

Посів на чашки. Краплю досліджуваної рідини наносять на поверхню цукрово-кров'яного або печінкового агару, розлитого тонким шаром (приблизно 3–5 мм) у чашці Петрі. Потім краплю шпателем злегка втирають в агар і послідовно переносять шпатель ще на 2 – 3 чашки. Чашки поміщають у микроанаеростат (або GENBOX) кришкою зверху і вирощують при температурі 35 – 37 ºС.

З метою підтримки достатнього вакууму на дно анаеростата ставиться відкрита чашка Петрі з лужним розчином пірогалолу. Через добу колонії C.вotulinum виглядають у виді прозорих росинок димчастого кольору, діаметром 0,1 – 0,2 см, оточені зоною гемолізу.

Через те, що при великому забрудненні досліджуваних проб сторонньою мікрофлорою виникають труднощі у виділенні C. вotulinum, особливо типу Е через те, що чутливість спор цього мікроба до нагрівання не відрізняється від чутливості вегетативних форм деяких мікробів, рекомендується простий метод виділення чистої культури мікроба, заснований на стійкості спор C.вotulinum до 50% спирту.

До 2 см³ культуральної рідини 2 – 3-денні інкубації при 28 ºС, що містить ботулінічний токсин типу Е, додають рівний обсяг етилового спирту-ректифікату. Суміш витримують 1 годину при кімнатній температурі, періодично перемішуючи, а потім з неї роблять висів на 2 – 3 чашки з печінковим агаром, що містить жовток курячого яйця (жовток одного яйця додають у 500 см³ розплавленого й охолодженого до (45-50) ºС агару). Через 48 годин інкубації при 35 ºС в анаеростаті, серед колоній сторонньої мікрофлори, C.вotulinum дають невеликих розмірів колонії, оточені “перловим поясом”. Слід зазначити, що деякі спорогенні анаеробі (C.sporogenes тощо) також мають навколо колоній “перловий пояс”. Ці колонії висівають у пробірки із середовищем типу Тароцци, досліджують після інкубації в термостаті в РН. Особливо цей метод рекомендується для виділення чистої культури C.вotulinum типу Е.

При відсутності в лабораторії анаеростатів або GENBOX для вирощування анаеробів можна використовувати простий чашковий метод, при якому повітря просто виключається з поживного агару. Метод полягає в наступному: засіяний і злегка охолоджений агар наливається в кришку стерильної чашки Петрі, після чого на агар, що майже застиг, міститься друга половина чашки Петрі так, щоб дно її щільне стикалося з поверхнею залитого агару. Краї чашки можна залити парафіном. При цьому методі поверхня скла щільно стикається з агаром по всій його площі, і в шарі агару, що знаходиться між пластинами скла, створюються умови, сприятливі для росту самих строгих анаеробів.