Страница 14: Статус Проект Порядок розслідування, обліку і проведення лабораторних досліджень у випадках харчових отруєнь. Інструкція (45104)

Четвертий день

З культури на скошеному агарі готують мазки і фарбують їх за Грамом. Одночасно визначають каталазну активність штамів. Для чого на очищене, знежирене скло наносять краплю 1% водяного розчину перекису водню і в ній розтирають петлю культури, якщо пухирці газу не виділяються, значить реакція негативна. Грампозитивні, каталазонегативні диплококи вивчають по тестам представленим у таблиці 30. Посів на середовище з 2,3,5-ТТХ не роблять, тому що ця речовина входить у середовище Ентерококагар. Усі посіви поміщають у термостат при (37±1) ºС на 24 години.

Таблиця 30

Диференційні ознаки ентерококів патогенних для людини

П’ятий день

Через 24 години посіви переглядають і реєструють результати.

Діагноз ентерококового харчового отруєння підтверджується, якщо в інкримінованому продукті і випорожненнях хворих були виявлені протеолітичні штами ентерококів у кількостях більш ніж 106 у 1 г/см3 продукту і більш ніж 104 у грамі калу при типовій клінічній картині захворювання.

18. СПОРОНОСНІ АНАЕРОБИ – C. botulinum

18.1. Загальні положення

Ботулізм – важке харчове бактеріальне отруєння з високою летальністю. В усіх країнах ботулізм пов'язаний, головним чином, із продуктами домашнього приготування, заготовленими про запас. Загальноприйняті в домашніх умовах способи обробки харчових продуктів, такі як консервування в банках, копчення, маринування, соління та ін., не приводять до знищення збудників ботулізму і їх спор і при тривалому збереженні в цих продуктах може утворитися токсин.

Збудники ботулізму широко поширені в природі. Вони виявляються у ґрунті, у гної, на фруктах і овочах, у рибі, у фуражі, в екскрементах теплокровних тварин. Широке поширення збудників ботулізму в ґрунті неминуче веде до потрапляння цих мікробів на овочі і фрукти, а також до обсіменіння різної сировини, що йде для приготування консервів, ковбас і інших продуктів. Інтенсивність зараження залежить від санітарних і технологічних умов обробки і збереження продуктів.

Сьогодні відомо 8 серологічних варіантів ботулінічного токсину А, В, C1, C2, D, Е, F, G. Для людини особливо небезпечними є серологічні варіанти А, В, Е та F, а серовари ботулотоксина С та D визначались лише в поодиноких випадках. C.botulinum типів – дуже близькі за морфологією, культуральним властивостям і дії їх токсинів на організм людини і тварин. Усі вони дають однакову клінічну картину хвороби. Зазначені типи ботулінічного мікроба відрізняються антигенними властивостями токсинів, що вони продукують. Це означає, що токсин кожного типу нейтралізується сироваткою того ж типу.

По морфології C.botulinum являють собою невеликі палички довжиною 4 – 9 ммк і шириною 0,6 – 0,9 ммк з закругленими кінцями, капсул не утворюють, рухливі, мають від 4 до 35 джгутиків. C.botulinum утворюють субтермінальні або термінальні спори; палички зі спорою мають вид тенісної ракетки. Легко фарбуються різними аніліновими фарбами. Молоді клітки фарбуються за Грамом позитивно. При старінні культури (через 4–5 діб росту) палички фарбуються грамнегативно.

Збудники ботулізму – облігатні анаероби, ростуть без доступу повітря, тому звичайно розмножуються й утворюють токсин усередині великих шматків риби, шинки, ковбаси, або в герметично закритих банках консервів. Установлено, що збудники ботулізму типу Е, а також непротеолітичні штами типу В і деякі штами типу F утворюють на поживних середовищах та у харчових продуктах крім токсину і нетоксичний попередник токсину – протоксин, що, не вбиваючи мишей при парентеральном уведенні, виявляє свою біологічну активність при попаданні в шлунково-кишковий тракт людини і тварин внаслідок впливу на нього протеолітичних ферментів.

При додаванні протеолітичних ферментів (трипсину, панкреатину) in vitro також відбувається активація протоксина і перехід його у токсин. Цей феномен варто враховувати при проведенні лабораторної діагностики ботулізму.

Нерідко консервні банки, куди разом із продуктами попадає і C.botulinum, виявляються бомбажними за рахунок утворення мікробом газу, однак часто при наявності мікробів ботулізму і ботулінічних токсинів харчові продукти виглядають зовсім доброякісними і консервні банки не дають “бомбажу”. Іноді відзначається специфічний запах прогірклої олії. Найбільш придатною температурою для росту C.botulinum типів A, B, C, D є температура 35 ºС, для типів E, F – 28, 30 ºС.

Ботулінічні токсини досить стійкі до температурних впливів. Токсин іноді руйнується тільки при кип'ятінні протягом 10-15 хвилин і не руйнується в шлунково-кишковому тракті під впливом травних ферментів. Лабораторна діагностика ботулізму має на меті виявлення ботулінічного токсину або C.botulinum в харчових продуктах, що викликали отруєння, а також у матеріалах, узятих від хворого або в органах із трупів. При цьому важливо встановити не тільки присутність токсину або мікроба, але і визначити їх тип, з метою підтвердження клінічного діагнозу і призначення правильного лікування.

18.2. Бактеріологічні дослідження

Перший день

Проби, що надійшли в лабораторію, досліджують одночасно у двох напрямках: проводять виявлення ботулінічних токсинів і C.botulinum. Дві третини, попередньо підготовленої, як зазначено вище, проби призначають для виявлення ботулінічних токсинів, одна третина – для посівів з метою виявлення C.botulinum.

Частину проби, що досліджують на наявність токсинів, витримують протягом 1–1,5 годин при кімнатній температурі для екстрагування токсинів, фільтрують через ватно-марлевий фільтр або центрифугують при 2500 – 3000 об/хв. протягом 15–20 хвилин. Фільтрування через тальковий фільтр неприпустимо, тому що тальк сорбує на собі ботулінічні токсини.

Для виявлення ботулінічних токсинів з отриманими фільтратами або надосадовою рідиною ставлять реакцію нейтралізації токсину антитоксичною сироваткою (РН).

18.2.1. Виявлення ботулінічних токсинів у реакції нейтралізації

Дослідженню на наявність токсину можуть підлягати промивні води шлунку, залишки їжі з шлунку, сеча і випорожнення хворого, секційний матеріал (2-3 шматочка по 5- з серця, печінки, селезінки, нирок, головного мозку, стінки шлунку, товстого та тонкого кишечнику), кров з серця, харчові продукти, фураж тощо.

З секційного матеріалу (найбільш часто токсин знаходять у печінці), згустків крові, вмісту кишечнику та з випорожнень роблять екстракти. Екстрагування токсинів з продуктів, що містять повірену сіль, проводять дистильованою водою. Настоювання досліджуваного матеріалу проводять протягом 1-2 годин. Після чого фільтрують через вату. Отримана після фільтрації рідина, а також сироватки крові, сеча можуть бути використані для реакції нейтралізації.

Для визначення токсину в харчових продуктах, враховуючи можливість гніздного розташування його, проби матеріалів відбирають по 20- у місцях, найбільш підозрілих за органолептичними властивостями, гомогенізують і заливають подвійним об’ємом фізіологічного розчину. Після 2-годинної експозиції екстракт центрифугують і ставлять РН.

Примітка. Враховуючи, що значна частина токсину типу Е продукується у вигляді протоксину, що активізується під дією травних ферментів, для виявлення токсину типу Е екстракт з продуктів перед постановкою РН рекомендується активізувати панкреатином або трипсином (1 см3 розчину ферментів на 10 см3 екстракту). Суміш екстракту з ферментом витримують при температурі (37±1) ºС протягом 2 годин.

Використовуються сухі типоспецифічні діагностичні ботулінічні сироватки. В 1 см3 типоспеціфічної сироватки типу А міститься не менше 200 МО, типу B не менше 100 МО, типу C – не менше 150 МО, типу E – не менше 200 МО, типу F – не менше 50 МО антитоксину.

Заборонено користатися для цілей діагностики лікувальними протиботулінічними сироватками.

Для виявлення токсинів для кожної проби використовують мишей вагою 16 – . У зв'язку з тим, що в досліджуваному матеріалі може бути один або кілька типів ботулінічних токсинів, попередню реакцію ставлять із сумішшю сироваток діагностичних ботулінічних типів A, B, C, E, F. Доза сироватки, що рекомендують для РН, як правило, забезпечує нейтралізацію гомологічного токсину в досліджуваній пробі, тому що в організмі і виділеннях хворих, а також в екстрактах з харчових продуктів, дуже сильні токсини майже не зустрічаються.

Для постановки РН готують суміш з рівних обсягів моновалентних сироваток типів A, B, C, E, F. Сироватки кожного типу набирають різними піпетками.

До 1 см3 суміші сироваток A, B, C, E, F додають 4 см3 досліджуваного матеріалу, витримують при кімнатній температурі не менше 30 хвилин, після чого по 1 см3 суміші вводять чотирьом мишам внутрішньочеревно або підшкірно. Чотирьом контрольним мишам вводять по 0,8 см3 досліджуваного матеріалу без сироватки.

Реакцію можна проводити також на 2-х морських свинках. Першій вводять внутрішньочеревно або підшкірно по 0,5 см3 суміші сироваток та 3 см3 досліджуваного матеріалу, витриманого при кімнатній температурі не менше 30 хвилин. Контрольній свинці вводять 3 см3 досліджуваного матеріалу без сироватки.

Спостерігають за тваринами протягом 4 днів. Якщо тварини, що отримали досліджуваний матеріал без сироватки за цей час гинуть, а ті що отримали досліджуваний матеріал з сироваткою залишаються живими, це вказує на присутність ботулінічного токсину в досліджуваному матеріалі. Орієнтовна відповідь може бути видана на другу добу.

Для визначення типу токсину у 6 пробірок розливають по 2,4 см3 досліджуваного матеріалу, потім в кожну пробірку додають 0,6 см3 сироватки. В першу – типу А, другу – типу В, в третю – типу С, четверту – типу Е, п’яту – типу F, в шосту вносять 0,6 см3 0,9% розчину хлористого натрію. Вміст пробірок перемішують і залишають при кімнатній температурі на 30 хвилин, після чого вміст кожної пробірки вводять по 1,0 см3 двом білим мишам. Для кожної сироватки використовують окремий шприц.

Для більш швидкої ідентифікації типу токсину РН з досліджуваним матеріалом ставлять одночасно з сумішшю і окремими типоспеціфічними сироватками.

Облік результатів проводять попередньо через 4-6 годин, через 24 години і остаточно через 4 дня.

Ботулінічний токсин не дає миттєвої загибелі тварин (протягом декількох хвилин або секунд), миші гинуть не раніше, ніж через 4 – 5 годин.

Звичайно картина хвороби і загибелі мишей дуже характерна: з'являється хекання, стан повного розслаблення м'язів, западання черевної стінки (“осина талія”), паралічі і судоми перед смертю.

Миші, що отримали суміш гомологічного токсину і сироватки, залишаються живими при загибелі усіх інших мишей. Якщо досліджуваний матеріал нейтралізується одночасно сироватками Е та F, що пов’язано з наявністю спільних антигенів, додатково ставлять реакцію нейтралізації з сироватками, розведеними у 40 разів. При цьому нейтралізується лише гомологічний токсин.

Особливу увагу потрібно звернути на постановку РН із сироваткою хворого, тому що її звичайно буває мало. Варто ретельно відокремити сироватку від згустку крові, який необхідно посіяти, тому що при ботулізмі можна знайти в крові паличку ботулізму, а із сироваткою поставити РН. У цьому випадку, слід відразу поставити розгорнуту РН з моновалентними ботулінічними сироватками тільки типів А, В, Е, тому що інші типи ботулінічних паличок зустрічаються дуже рідко.

При одержанні позитивного результату РН з діагностичними ботулінічними сироватками дають висновок про наявність у досліджуваному матеріалі ботулінічного токсину і вказують його тип.