Статус Проект Порядок розслідування, обліку і проведення лабораторних досліджень у випадках харчових отруєнь. Інструкція

Останні роки значну роль у поширенні захворювань сальмонельозного походження грають курячі яйця. Небезпеку представляють також яєчні продукти: меланж, яєчний порошок. Молоко і молочні продукти займають більш скромне місце в поширенні сальмонельозів, однак, у разі їх інфікування вони виявляються причиною виникнення значних спалахів.

Епідеміологічна роль риби і рибних продуктів відносно невелика, разом з тим відомі випадки, коли риба гарячого копчення, різні рибні блюда і навіть оселедець пряного засолу виявлялися причиною виникнення захворювань сальмонельозом. Необхідно відзначити також, що деякі з холоднокровних тварин, яких вживають у їжу в деяких країнах, можуть виявитися причиною захворювань (устриці, черепахи, змії, жаби та ін.). Інфікованими можуть виявитися продукти не тільки тваринного походження, але і рослинного (овочі, фрукти, ягоди, білкові концентрати із сої, різні злаки, сушені фрукти й ін.). Описано випадки, коли причиною спалахів харчових токсикоінфекцій та сальмонельозів виявлялися харчові дріжджі, кондитерська фарба кармін тощо.

Найбільшу небезпеку представляють продукти і страви, які після готування не піддаються термічній обробці, і, особливо, якщо вони довго зберігаються при кімнатній температурі. Готові страви і продукти можуть бути, як первинно інфіковані (м'ясо, молоко, яйця хворих тварин і птахів), так і вторинно, забрудненими в процесі їх кулінарної обробки (через руки, інфікований інвентар, при неправильному зберіганні і транспортуванні).

Варто пам'ятати, що навіть при інтенсивному розмноженні сальмонел у харчових продуктах, вони не змінюють їх смак, запах, зовнішній вигляд.

9.2. Бактеріологічні дослідження

Другий день Переглядають посіви на щільних поживних середовищах і пересівають 3-5 підозрілих колоній у пробірки із комбінованими середовищами – Олькеніцького (Кліглера). На комбіновані середовища посів роблять спочатку штрихами по скошеній частині, а потім уколом усередину стовпчика. Для прискорення дослідження можна підозрілі колонії, паралельно з пересівом на комбіновані середовища, пересівати на скошений м’ясо-пептонний агар.

Пробірки з посівами інкубують у термостаті при температурі (371) ºС до наступного дня.

Розмір колоній на щільних поживних середовищах при посіві помірної густоти сягає 1-2 мм, але зустрічаються і карликові колонії.

На середовищі Ендо сальмонели ростуть у вигляді круглих, безбарвних чи злегка рожевих прозорих ніжних колоній. На середовищі Плоскірева колонії сальмонел також безбарвні, але більш щільні і дещо менших розмірів. На вісмут-сульфіт агарі сальмонели, як правило, ростуть у вигляді чорних колоній, з характерним металевим блиском, при цьому спостерігається прокрашування в чорний колір ділянки середовища під колонією. Виключення складають S.Paratyphi A і деякі серологічні типи з групи С та інших груп, що при рості на цьому середовищі утворюють ніжні, світло-зелені колонії. Посіви на вісмут-сульфітному агарі переглядають додатково через 48 годин.

Якщо на чашках підозрілі колонії відсутні, відповідь видають тільки після обліку результатів висівів із середовищ збагачення.

У випадку, якщо в результаті прямого посіву випорожнень не виросло жодної колонії, здійснюють повторний висів, збільшивши порцію матеріалу, що засівається. При повторній відсутності росту варто отримати матеріал для досліджень ще раз.

З посівів жовчі в бульйон і вихідної жовчі, що містяться в термостаті, роблять перший висів на чашки із вісмут-сульфітним агаром і середовищем Плоскірева.

З посіву крові в жовчний бульйон (середовище Раппопорт) роблять висів на чашку із середовищем Ендо, або зі звичайним поживним агаром (рН 7,2 – 7,4), а первинний посів крові знову поміщають у термостат.

Через 18 – 20 год. проводять висіви із середовищ збагачення на щільні поживні середовища.

Третій день Проводять попередню ідентифікацію культур, висіяних напередодні на середовища Олькеніцького (Кліглера), по ферментації лактози, глюкози, сахарози, гідролізу сечовини, утворенню сірководню, а також за серологічними властивостями, що визначають у реакції аглютинації на склі з полівалентними сироватками.

Якщо культури ферментують лактозу і глюкозу з утворенням газу і гідролізують сечовину, вони не належать до бактерій роду Salmonella.

Культури, що не ферментують лактозу і не гідролізують сечовину, але ферментують глюкозу (з утворенням чи без утворення газу), утворюють сірководень піддаються подальшому вивченню.

Культури, що не ферментують лактозу, ферментують глюкозу без газоутворення, не утворюють сірководень і не гідролізують сечовину підозрілі як паратифозні чи дизентерійні. Їх випробовують у реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними та шигельозними сироватками і подальше вивчення роблять в залежності від результату аглютинації.

Культури, що не ферментують лактозу, ферментують глюкозу з утворенням газу, не утворюють сірководню і позитивні в реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними сироватками можуть належати до роду Salmonella.

Усі підозрілі культури пересівають на поживні середовищa мінімального диференційного ряду (таблиця 1) для підтвердження приналежності даної культури мікроорганізмів до роду Salmonella і проводять серологічну ідентифікацію.

Для прискорення досліджень, отримання відтворюваних результатів доцільно для біохімічної ідентифікації використовувати діагностичні системи та набори, що зареєстровані в Україні, типу: ЕНТЕРОтест (PLIVA-Lachema), АРІ (bioMereux) та ін.

Таблиця 1

Біохімічні властивості родів родини Enterobacteriaceae, що зустрічаються найчастіше

Тест або субстрат

Salmo-nella

Shigella

Esche-richia

Citro-bacter

Kleb-siella

Proteus

Цитрат Сімонса

+,-

-

-

+

+

Х

Сечовина

-

-

-

Х

(+)

+,-

Малонат натрію

-,+

-

-

-,+

+

-

Рухливість

+,-

-

+,-

+

-

+,-

Індол

-

-,+

+,-

-,+

-,+

+,-

Сірководень

+,-

-

-

+,-

-

+,-

VP

-

-

-

-

-

-,+

MR

+

+

+

+

+

+

Фенілаланін- дезаміназа

-

-

-

-

-

+

Лізин-декарбоксилаза

+,-

-

+,-

-

+

-

Орнітин-декарбоксилаза

+

-,+

Х

Х

-

-,+

Цитрат Крістенсена

Х

-

Х

+

+

Х

Умовні позначення: + – ферментація середовища

- – середовище не ферментується

+,- – середовище ферментується, деякими варіантами не ферментується

-,+ – середовище не ферментується, деякими варіантами ферментується

Х – варіанти стосовно даної ознаки

Серологічну ідентифікацію сальмонел починають з випробовування їх у реакції аглютинації на склі із полівалентною сироваткою АВСДЕ, що включає в себе аглютиніни до О-антигенів 2, 4, 61, 62, 7, 8, 9 і 3-10, 12, Vi. При відсутності реакції аглютинації з зазначеною сироваткою, культуру випробовують із полівалентною сироваткою до рідких груп сальмонел, що включає антитіла до антигенів 11, 13-22, 14-34, 15, 19, 23 та ін.

При одержанні позитивних результатів аглютинації з однією з полівалентних сироваток, культуру випробовують з кожною із О-сироваток, що входять до її складу окремо, для визначення приналежності її до однієї з О-груп.

Після встановлення належності культури до визначеної О-групи її випробовують з Н-сироватками спочатку першої фази, а потім – другої. Починати слід з Н-сироваток, що відповідають більш розповсюдженим серологічним типам сальмонел даної групи.

Після визначення Н-антигена першої фази, визначають Н-антигенні компоненти другої фази і у такий спосіб встановлюють антигенну формулу виділеної культури, тобто її серологічний варіант. При позитивному результаті реакції аглютинації виділеної культури з відповідними сироватками можна видати попередню відповідь про вид сальмонел.

Для аглютинації з О-сироваткою культуру варто брати з верхньої частини росту на скошеному агарі, для аглютинації з Н-сироватками – із самої нижньої частини росту культури чи з конденсату, де розташовуються мікроорганізми з найбільш розвинутим Н-антигеном.

На третій день дослідження переглядають чашки з висівами із середовищ збагачення і підозрілі колонії відсівають на середовища Олькеніцького чи Кліглера.

Якщо при первинному посіві і при висіві із середовищ збагачення підозрілих колоній не виявлено, може бути видана відповідь про негативний результат дослідження.

Посіви на вісмут-сульфіт агарі (із середовища збагачення), незалежно від результатів перегляду, залишають у термостаті ще на 24 години. У цей же день переглядають чашки з першим висівом із флакона з засіяною кров'ю і дуоденальним вмістом, підозрілі колонії пересівають на середовище Олькеницького чи Кліглера і роблять другий висів на чашки.

Крім перелічених вище методів ідентифікації виділених культур і пересівів, на третій день роблять посів виділеної культури для дослідження її на чутливість до сальмонельозного О-бактеріофагу.

Для цього дві краплі 4 або 18 годинної бульйонної культури досліджуваного штаму наносять тонко відтягнутою пастерівською піпеткою або петлею (діаметр 0,4-0,5 мм) на добре підсушений слабко лужний агар у чашці Петрі. Після підсихання на одну з крапель, петлею або пастерівською піпеткою меншого діаметру, наносять О-бактеріофаг, а на іншу, як контроль – краплю бульйону. Фаг наносять у робочому розведенні, зазначеному на етикетці. На одній чашці, таким чином, можна випробувати одночасно 5-6 культур. Чашки з нанесеними культурами і О-бактеріофагом поміщають у термостат при (371) ºС на 18-20 годин, після чого проводять облік результатів.

Поява на місці нанесення фага чітко обмеженої зони зливного лізису або більшого чи меншого числа негативних колоній, чітко видимих неозброєним оком, свідчить про чутливість культур до О-бактеріофагу.

При відсутності лізису в місцях нанесення фага буде суцільний ріст культури, як у контролі.

О-фаг може бути використаний для попереднього дослідження культури з чашки з диференційним середовищем.

Культура, що лізується О-фагом, є підозрілою на сальмонелу і може бути прямо з чашки випробувана в реакції аглютинації із полівалентними сальмонельозними О-сироватками.

Атипові сальмонельозні культури в більшості випадків чутливі до О-фагу, у той час як культури, подібні із сальмонелами за біохімічними властивостями (наприклад, лактозонегативні Е.coli), як правило, не лізуются цим фагом.

Четвертий день Облік результатів посівів на мінімальний диференційний ряд.

При виділенні культур грамнегативних рухливих паличок, що ферментують глюкозу з утворенням або без утворення газу, не ферментують лактозу і сахарозу, не гідролізують сечовину і не утворюють індолу, утворюють сірководень, та мають інші характерні для цього роду біохімічні властивості і мають чітку серологічну характеристику – видають відповідь про виділення сальмонел.

Деякі з найбільш широко розповсюджених сероварів підлягають подальшому вивченню з метою визначення внутрішньосероварної диференціації або епідемічного маркування. У таблицях 2 - 6 представлені схеми типування найбільш розповсюджених сероварів сальмонел.

Культури, що мають відхилення від типових властивостей – піддаються подальшому вивченню.

Переглядають чашки із другим висівом дуоденального вмісту з бульйону і третій висів з останнього на щільні середовища.

При негативних результатах перших двох висівів з жовчного бульйону з посівом крові, висіви повторюють на 5-й і 10-й дні.

При ідентифікації культур, підозрілих на сальмонели, найчастіше викликають труднощі, при вивченні бактерій біохімічно подібних до сальмонел, але які не аглютинуються сальмонельозними сироватками, або які дають аглютинацію, але мають відхилення по біохімічним властивостям.

У таких випадках, насамперед, необхідно переконатися в чистоті культури, для чого її розсівають на середовищі Ендо, відбирають найбільш типові колонії і піддають їх додатковому вивченню.

Посів культури в рідке середовище, що містить підвищену кількість лактози (4%) і знижену кількість пептону (0,3-0,5%) дозволяє в більш ранній термін виявити відношення до лактози.

У випадку виділення культур, що аглютинуються сумішшю О-сироваток рідких груп, але не аглютинуються ні однієї з О-сироваток, що входять у суміш, досліджують такі культури на здатність ферментувати саліцин, малонат натрію, адоніт, дульцит, сорбіт, а також у реакціях VP та MR. За допомогою цих тестів вдається диференціювати бактерії роду Salmonella від представників інших родів родини Enterobacteriaceae, що мають загальні антигенні комплекси із сальмонелами.

Для виявлення відсутньої фази джгутикового антигену варто зробити посів в U-подібну трубочку, заповнену напіврідкими (0,2%) агаром. Для виявлення найбільш рухливих мікроорганізмів потрібно переглядати ріст через 4-6 годин і на наступний ранок. З появою росту в іншому коліні, відразу ж роблять пересів з останнього на свіжоскошений агар. Так вловлюються найбільш рухливі мікроорганізми.

Для визначення відсутньої фази Н-антигена використовують також посів за Свеном-Гардом. Принцип його полягає в тому, що на напіврідкому агарі (0,6%) рояться всі рухливі мікроорганізми. Якщо додати до агару 1-2 краплі сироватки відомої фази, тобто тієї фази, що була визначена, то вона зв'яже виявлений антиген, а мікроорганізми, багаті іншим, невідомим антигеном будуть бурхливо роїтися. Цей антиген легко може бути виявлений при дослідженні культури, взятої з краю макроколонії, у реакції аглютинації з Н-сироватками.

Таблиця 2

Скорочена схема визначення біоварів S.Typhimurium

Позначення біовару

Рамноза

Інозит

a

+

+

b

+

-

c

-

-

d

-

+

Таблиця 3

Схема визначення біоварів S.Enteritidis

Біовари

Бульйон Штерна

jena

+

ratin

-

Таблиця 4

Схема визначення біоварів S.Typhimurium ( повна схема)

Позна-чення біовару

Арабі-ноза

Ксило-за

Рамно-за

d-тарт-рат

i-тарт-рат

Мукат

Інозит

1

+

-

-

-

-

-

-

2

+

+

-

-

-

-

-

3

+

+

+

-

-

-

-

4

+

+

+

+

-

-

-

5

+

+

+

+

+

-

-

6

+

+

+

+

+

+

-

7

+

+

+

+

+

+

+

8

+

-

+

+

+

+

+

9

+

+

-

+

+

+

+

10

+

+

-

+

+

-

+

11

-