Статус Проект Порядок розслідування, обліку і проведення лабораторних досліджень у випадках харчових отруєнь. Інструкція

Вирослі колонії розглядають за допомогою лупи або стереоскопічного мікроскопу. Частину колоній використовують для готування мазків для мікроскопії.

З поверхні чашки колонії знімають петлею або пастерівською піпеткою і засівають на пробірки із середовищем типу Тароцци з 0,5% глюкози. Вирослі посіви перевіряють на частоту шляхом мікроскопії і на наявність токсину шляхом постановки РН на мишах.

Метод активації протоксина C. вotulinum Активацію протоксинів роблять в екстрактах з харчових продуктів, промивних вод шлунка і блювотних мас, а також культуральної рідини посівів, якщо досліджуваний матеріал був засіяний у середовище без трипсину або панкреатину.

Чистий сухий трипсин розчиняють перед вживанням у фізіологічному розчині в концентрації 1:100 (1%-й розчин); цей розчин приймають за вихідний. Для активації беруть даний розчин з розрахунку, щоб в активуємій культуральної рідини його концентрація дорівнювала 0,1%.

Трипсин може бути замінений сухим медичним високоактивним (активність не повинна бути менше 50 одиниць) панкреатином, розчин якого готують у такий спосіб: 4 см³ панкреатину розчиняють у 100 см³ фізіологічного розчину і залишають у холодильнику при (6±2) ºС протягом ночі. Перед вживанням отриману рідину фільтрують через щільний паперовий фільтр, а потім через пластинку фільтра Зейтца, що стерилізує, до одержання прозорої опалесцентної рідини. Готовий розчин панкреатину може зберігатися при (6±2) ºС протягом двох тижнів.

Досліджувану 4 – 5-добову культуру, отриману на рідкому м'ясному або казеїновому середовищі, піддають центрифугуванню або фільтруванню з метою відділення мікробних тіл від культуральної рідини.

Готовий розчин трипсину додають з розрахунку одержання в культуральної рідини концентрації 0,1%, для чого на 1 см³ культуральної рідини беруть 0,1 см³ вихідного 1% розчину трипсину.

Якщо замість трипсину застосовують панкреатин, то культуральну рідину змішують у рівних пропорціях з готовим розчином панкреатину.

Отримані суміші поміщають у термостат при (37±1) ºС на 1 годину. Після закінчення зазначеного терміну в активованій рідині визначають наявність ботулотоксину на білих мишах шляхом постановки РН.

19. СПОРОНОСНІ АНАЕРОБИ – C. рerfringens

19.1. Загальні відомості

В даний час відомо, що C.рerfringens типів А, В, С, D, Е викликають ряд захворювань людини і тварин. Установлено, що причиною харчових токсикоінфекцій у людей можуть бути C.рerfringens типів А і С, з яких краще вивчені харчові отруєння, обумовлені штамами типу А. Роль C.рerfringens, типів В, D, Е в патології людей мало вивчена. Однак, у зв'язку з тим, що вони викликають важкі ентеротоксемії в дрібної і великої худоби, а також у птахів, можна припускати їх етіологічне значення при харчових отруєннях у людей, у випадку вживання в їжу м'яса тварин, контамінованих штамами типів В, С, D, Е, що продукують летальні, некротичні і гемолітичні токсини (β, r, i).

Встановлено, що при харчових токсикоінфекціях, викликуваних C. рerfringens типу А, основну роль у патогенезі захворювання грає ентеротоксин, що продукується in vivo спорулюючими клітками цих мікроорганізмів, що попадають у шлунково-кишковий тракт при інтенсивній контамінації харчових продуктів (10⁶ і більше у см³/г) зазначеними бактеріями.

C. рerfringens типів А, В, С, D, Е – факультативні анаеробі, що ростуть в умовах повного або неповного вакууму (не менш 0,4 атм.), являють собою великі грампозитивні палички, здатні до поліморфізму, нерухомі. Утворюють центральні або субтерминальні спори, які у деяких штамів типів А і С можуть витримувати кип'ятіння від 1 до 6 годин. Оптимальна температура для культивування C. рerfringens, знаходиться в межах 37 – 45 ºС, однак активний синтез токсинів ά, β, έ, і) відбувається при температурі 37 ºС. Ріст культури на рідких поживних середовищах супроводжується сильним газоутворенням. На щільних поживних середовищах C.рerfringens утворює різні форми (S, M, R) безбарвних колоній, що на агарі з кров'ю звичайно оточені зоною гемолізу, на агарі з жовтком – зоною перламутрового преципітату різної інтенсивності. На середовищі Вильсона–Блер колонії що вирослі, мають інтенсивний чорний колір.

C.рerfringens викликає зброджування лакмусового молока, що супроводжується просвітлінням сироватки й утворенням згустку цегляно-червоного кольору. Ферментують з утворенням кислоти і газу глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, галактозу. Не зброджують маніт і дульцит. У тканинах людини і тварин, а також на штучних поживних середовищах C.рerfringens типів А, В, С, D, Е можуть продукувати летальні, некротичні і гемолітичні токсини, що нейтралізуються типовими, специфічними, антитоксичними сироватками.

C.рerfringens типів D і Е виробляють протоксини (подібно C.вotulinum типів С, Е і F), здатні переходити в активні токсини під впливом протеолітичних ферментів. Бактерії виду C.рerfringens (особливо типу А) широко поширені в довкіллі (ґрунт, вода, харчові продукти і т.д.), присутні у вмісті кишечнику людей і тварин.

Харчові отруєння частіше мають місце після вживання готових м'ясних блюд, а також продуктів рослинного походження, що виявляються значно забрудненими клітками C.рerfringens типу А в результаті порушення правил готування і збереження їжі.

19.2. Бактеріологічні дослідження

У харчових продуктах і матеріалі від хворого (крім крові) визначають:

наявність бактерій C.рerfringens і масивність контамінації цими мікроорганізмами;

наявність токсигенних штамів C.рerfringens типів А, В, С, D, Е.

У крові хворого з явищами анаеробного сепсису і секційних матеріалах визначають:

наявність C.рerfringens типів А, В, С , D, Е і їх специфічних токсинів.

Перший день З підготовлених до дослідження матеріалів (харчові продукти, блювотні маси, випорожнення й ін.) готують розведення на 0,1% пептонній воді до 10^-10.

По 1 см³ матеріалу з відповідних розведень переносять у розплавлене й охолоджене до 45 ºС середовище Вильсона – Блер, розлите по 8 – 9 см³ у пробірки. Можна також використовувати кров'яний або жовтковий агари в чашках. Для цього 1 см³ кожного розведення додають у 15 см³ охолодженого до 45 ºС агару, ретельно перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі. Після застигання суміші заливають додатково стерильним, охолодженим до 45 ºС 2% м’ясо-пептонним агаром, шаром не менш 2 мм. Інкубують 6 – 8 годин у термостаті при 45 – 46 ºС або 20 годин при (37±1) ºС.

Крім того, гомогенати досліджуваних матеріалів засівають в об’ємі 10 – 15 см³ на кожне з рідких середовищ, розлитих по 70 см³ у флакони^.

Кожен зразок матеріалу (крім крові) вносять у 2 флакони однакового середовища, один флакон з посівом прогрівають при 80 ºС 20 хвилин, а інший – не прогрівають, потім обидва флакони інкубують при (37±1) ºС. В умовах прогрівання звичайно гине стороння мікрофлора і частина анаеробів, що знаходяться у вегетативній формі. Зберігаються спори C.рerfringens, що у цих умовах активно проростають. У вирослих культурах із прогрітих посівів у ряді випадків може знаходитися тільки C.рerfringens, тобто чиста культура цих бактерій. Кров, у випадку бактеріємії, узята стерильно, буде містити тільки вегетативні клітки C.рerfringens. Тому посів крові проводиться без прогрівання.

Інтенсивне газоутворення, що свідчить про активний ріст культури, може спостерігатися через 3 – 6 годин після посіву матеріалу, доставленого не пізніше доби. У цьому випадку варто проводити бактеріологічні і токсикологічні аналізи в перший день дослідження. При відсутності активного росту через 6 – 8 годин, посіви інкубують при (37±1) ºС протягом 18 – 20 годин.

Другий день У посівах на середовищі Вильсона – Блер роблять підрахунок чорних колоній, де мається від 10 до 30 колоній, або на чашках, де міститься від 20 до 100 колоній із зоною гемолізу, або з зоною опалесценції. Множать кількість колоній на розведення матеріалу в цій пробірці, або чашці Петрі. Так, якщо в 6 пробірці або чашці міститься 30 характерних колоній, контамінації одного грама або одного см³ вихідного матеріалу буде складати 3010⁶. Роблять мазки з 3 – 5 характерних колоній, фарбують фарбою для анаеробів або за Грамом. Крім того, 2 – 4 колонії пересівають на лакмусове молоко і 3 – 5 колоній – на будь-які з м'ясних середовищ у пробірках для одержання чистої культури.

Визначення токсинів варто проводити через 3 – 6 годин після посіву матеріалу на рідкі середовища з появою ознак початку росту культури (див. перший день дослідження) або на другу добу, якщо посівний матеріал виростає тільки через 18 – 20 годин інкубації. З культур на рідких середовищах, де відзначений ріст із газоутворенням, готують мазки, фарбують їх за Грамом або фарбою для анаеробів. Ті посіви, у яких виявляють грампозитивні палички, схожі по морфології на C.рerfringens, перевіряють на присутність специфічних токсинів C.рerfringens типу А, В, С, D, Е Методом реакції нейтралізації з діагностичними сироватками C.рerfringens типів А, В, D, Е на білих мишах вагою 16 – 18 г^.

Сухі протиперфрингенс сироватки перед уживанням розводять 1 см³ дистильованої води. При легкому струшуванні сироватка цілком розчиняється. Потім сироватки А, В, D, Е розводять у 10 разів фізіологічним розчином і в розведеному виді застосовують для постановки РН.

Постановка реакції нейтралізації З флаконів у стерильних умовах відбирають по 8 – 10 см³ культуральної рідини. Культуру, що залишилася, у флаконах зберігають при температурі (6±2) ºС до закінчення дослідження. Після центрифугування при 3000 – 5000 об/хв. протягом 30 хв. у надосадовій рідині повинні знаходитися токсини C.рerfringens.

Спочатку ставлять РН токсину в досліджуваній рідині із сироваткою C.рerfringens типу А. Для цього в 2 пробірки вносять по 1,5 см³ надосадової рідини. Потім у 1 пробірку додають 0,75 см³ антитоксичної сироватки типу А, у 2-у контрольну – 0,75 см³ фізіологічного розчину. Суміш витримують 30 хвилин при 37 ºС, потім уводять по 0,75 см³ у хвостову вену 2-ом білим мишам вагою 16 – 18 г. Спочатку вводять суміш з контрольної пробірки, потім тим же шприцом – суміш з досвідченої пробірки. Реакцію враховують через добу.

Третій день 1. Переглядають пробірки з посівами на лакмусовому молоці. Поява характерного зброджування з просвітлінням сироватки й утворенням згустку цегельного кольору є додатковим підтвердженням того, що колонії чорного кольору, а також колонії з зонами гемолізу і преципітату на щільних середовищах, що визначають контамінацію досліджуваного матеріалу, відносяться до C.рerfringens. Враховують результати РН. Якщо контрольні миші упали, а ті, що отримали суміш токсину із сироваткою типу А – живі, варто дати висновок, що в досліджуваному матеріалі виявлений C.рerfringens типу А, активністю не менш 3 Dlm/см³ (для білої миші) і закінчити дослідження.

У тому випадку, якщо контрольні миші і що отримали суміш токсину із сироваткою типу А упали, варто ставити розгорнуту РН із сироватками C.рerfringens типів В, D, Е. Для виявлення штамів типів D і Е варто проводити активацію протеолітичними ферментами неактивних протоксинів, що продукують штами типів D і Е. Спосіб готування робочих розчинів протеолітичних ферментів викладений у розділі “Лабораторна діагностика ботулізму”.

Приготовлений 4% робочий розчин панкреатину додають до надосадової рідини в співвідношенні 1 см³ панкреатину до 3 см³ надосадовій рідині.

Для активації також можна користатися трипсином; для цього 1% робочий розчин трипсину додають до надосадової рідини до концентрації 0,1% (на 1 см³ надосадовій рідині беруть 0,1 см³ робочого розчину трипсину).

Суміш токсину з ферментом поміщають у термостат при (37±1) ºС на 1 годину, після чого розводять у 3 рази і ставлять розгорнуту РН з культуральною рідиною після активації ферментами для виявлення токсинів типу D і Е, а також, ставлять РН з неактивованою культуральною рідиною, розведеною в 2 рази для виявлення токсинів типів В і С.

Метод постановки розгорнутої реакції нейтралізації У п'ять пробірок розливають досліджувану надосадову рідину: у першу і другу пробірки – по 1,5 см³ без активації, у третю, четверту і п'яту – по 1,5 см³ рідини після активації. Додають по 0,75 см³ антитоксичні діагностичні сироватки: у першу пробірку – типу В, у третю – типу D і четверту – типу Е (усі сироватки розливають різними піпетками).

Друга і п’ята пробірки є контрольними на присутність токсинів, у них додають по 0,75 см³ фізіологічного розчину.

Суміш витримують 30 хвилин при (37±1) ºС і уводять внутрівенно по 0,75 см³ двом білим мишам з кожної пробірки. Для кожної проби береться окремий шприц.

Результати враховують через добу. При наявності токсинів C.рerfringens гинуть миші, що одержали розчин з контрольної пробірки. Виживають миші, що одержали суміш токсину з гомологічною сироваткою. Так, якщо в досліджуваному матеріалі знаходиться токсин типу В або типу С, виживуть миші, що одержали суміш досліджуваної культури із сироваткою типу В, контрольні миші упадуть. При виявленні токсину типу, що нейтралізується сироваткою, В варто вважати, що в досліджуваному матеріалі міститься C.рerfringens типу В або типу С. Присутність одного з токсинів типів В, С D, Е в досліджуваному матеріалі в сполученні з характерною клінічною картиною дає підставу вважати, що харчова токсикоінфекція викликана штамами одного з зазначених типів C.рerfringens.

Схема розгорнутої реакції нейтралізації

№№ пробірок

Надосадова рідина

Сироватки антиперфрингенс

Фізіологічний розчин контроль

типа В

типа D

типа Е

1 пробірка

1,5 см³ без активації

0,75

2 пробірка

1,5 см³ без активації

0,75

3 пробірка

1,5 см³ після активації

0,75

4 пробірка

1,5 см³ після активації

0,75

5 пробірка

1,5 см³ посля активації

0,75

Виділення чистої культури Чисту культуру C.рerfringens виділяють і досліджують у випадку нечіткого результату РН, при наявності в первинних посівах досліджуваного матеріалу (тобто у флаконах) змішаної культури, де, поряд з C.рerfringens, присутня стороння мікрофлора.

Чисту культуру C.рerfringens одержують шляхом пересіву на м'ясні середовища в пробірках окремих характерних колоній (чорні на середовищі Вильсона–Блер, а також оточені зоною гемолізу, чи перламутрового преципітату – на кров'яному або жовтковому агарах). Колонії на щільних середовищах виростають на 2-й день дослідження при вивченні контамінації матеріалу. Колонії, характерні для C.рerfringens, висівають (по 3–5 колоній з посіву кожного зразка досліджуваного матеріалу) на м'ясні середовища в пробірках (див. 2-й день досліджень).

Через 18–20 годин у вирослих посівах визначають методом мікроскопії наявність однорідної культури з морфологією, характерної для C.рerfringens. Пробірки з культурами зберігають при (6±2) ºС і використовують надалі для вивчення чистої культури.

Для виділення чистої культури з секційного матеріалу, що не вивчається на обсеменінність C.рerfringens, варто використовувати культури первинних посівів у флаконах (див. 2-й день дослідження, визначення токсинів). Для виділення окремих колоній використовують середовище Вильсона–Блер, а також кров'яний або жовтковий агари в чашках Петрі, куди стерильно вносять 1 – 2 краплі культури, потім роблять розсів на 2 – 3 чашки шпателем.

Посіви в чашках Петрі вирощують в анаеростатах протягом однієї доби при (37±1) ºС. Окремі колонії, що вирослі пересівають на м'ясне середовище в пробірках.

Для визначення типової приналежності виділених штамів C.рerfringens посівний матеріал із пробірок з м'ясним середовищем пересівають в об’ємі 2 – 3 см³ на одну з рідких поживних в середовищ флаконах.

У вирослій культурі встановлюють присутність специфічних токсинів C.рerfringens методом реакції нейтралізації з типовими антитоксичними діагностичними антиперфрингенс сироватками типів А, В, D, Е (див. 2-й день досліджень).

Критерії діагностики При наявності клінічних симптомів захворювання результати бактеріологічного дослідження підтверджують діагноз харчовий токсикоінфекції, викликаної C.рerfringens, якщо отримані наступні дані досліджень:

1. Висока контамінація C.рerfringens (більш 10⁶ у 1 г) харчових продуктів, що викликали отруєння.