До початку сторінка 21 з 26
Індикаторні бульйонні культури наносять перпендикулярно первинному штриху, не торкаючись його, по 5 індикаторних культур з кожної сторони або всі 10 з однієї (мал. 2).
Індикаторні культури засівають у суворій послідовності і нумерують тільки перший індикаторний штам. Після посіву чашки інкубують при (37±1) ºС ще протягом 18-20 годин.
П'ятий день Проводять облік результатів. Якщо досліджувана культура не коліциногенна, ріст всіх індикаторних культур буде неперервним по всій довжині.
Якщо випробовувані культури коліциногенні, то спостерігається гальмування росту чутливих до коліцину, що продукується, індикаторних культур. Як правило, ріст індикаторних штамів переривається за 3-6 мм до штриха досліджуваної культури. Величина зони інгібіції (гальмування) залежить від наступних причин:
1) концентрації коліцина в агарі. Тривале зберігання культур на простих середовищах тимчасово пригнічує продукцію коліцина;
2) швидкості дифузії у щільне поживне середовище. Швидкість дифузії залежить як від типу коліцина, так і від щільності поживного агару (не зберігати готові середовища у флаконах більш 2-х тижнів і завжди користуватися середовищем з однією і тією ж концентрацією);
3) часу росту первинної смужки досліджуваної культури. Найкращий термін інкубації 48 годин, але якщо в екстрених випадках він скорочується до 24 годин, зона пригнічення росту може бути виражена в межах 1,5-2 мм, що при відсутності належного досвіду ускладнить облік результатів. Збільшення інкубації понад 48 годин також небажано, тому що може в зв'язку з виснаженням середовища і зміною вологості з'явитися неспецифічне пригнічення росту більшості індикаторних культур. У тих випадках, коли по яких-небудь технічних причинах через 48 годин інкубації досліджуваної культури дослід не може бути продовжений, потрібно як звичайно простерилізувати чашки парами хлороформу, а потім поставити їх у холодильник. Зберігати такі чашки до нанесення індикаторних штамів без збитку для типування можна 2-3 доби;
4) зниження спектру чутливості окремих індикаторних культур. Необхідно проводити контроль стабільності індикаторних культур не рідше одного разу на місяць, або, принаймні, після кожного пересіву із середовища Дорсе на середовище Дорсе. Використовувати бульйонні культури тільки для типування і однократно (тобто не можна залишати на 1-2 дня для наступних дослідів). Для типування пересівати культури тільки із середовища Дорсе.
Облік результатів проводять відповідно схеми, що додається (таблиця 2). У випадках, коли встановлений тип не співпадає з одним із відомих типів, культуру розсівають на середовищі Ендо (перевіряють на чистоту) і типують декілька ізольованих колоній, а також перевіряють на стабільність індикаторні штами. При отриманні після цього аналогічних результатів з субкультурами досліджуваного штаму, такі культури позначають як ті, що не типуються. У зв’язку з можливостю знаходження нових коліциногено-типів, такі культури необхідно пересилати до обласних СЕС та Центральної СЕС МОЗ України у встановленому порядку.
При достатньому досвіді і хороших технічних навичках можна проводити посіви 2-х смужок досліджуваних культур на одну чашку на відстані між ними біля 3 см. Індикаторні культури наносять паралельно штрихами між досліджуваними (мал. 3). Облік проводять за звичайною схемою.
Ф орма реєстрації результатів у робочому журналі наведена нижче (таблиця 3).
Визначення типу коліцина, що продукується, за методом Аббота і Шеннона дозволяє протипуватии до 90-95% штамів S.sonnei. Серед інших видів збудників дизентерії феномен коліциногенії зустрічається набагато рідше, наприклад, S.flexneri коліциногенні: підвид Флекснера 0,5 –1,0%; підвид Ньюкасл 20,0 – 25,0%; підвид Бойда 40,0 –50,0%.
Таблиця 3
Форма робочого журналу для реєстрації визначення коліціногенної активності S.sonnei
№№ досліджуваних культур
Індикаторні штами
Тип
31
32
33
36
38
39
8218
40
43
44
18
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
7
271
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
11
350
+
-
+
-
+
-
-
-
-
+
8
367
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0
У зв'язку з цим особливого значення набуває метод визначення чутливості досліджуваних неколіциногених культур до визначених коліцинів, що продукуються еталонними культурами з колекції Фредеріка, тобто колицинотипування.
Чутливість шигел до коліцинів специфічна і залежить від наявності на поверхні бактеріальної клітки рецепторів для фіксації коліцинів. Окремим коліцинам або групі їх (наприклад, коліцинам групи Е) відповідають визначені рецептори. Крім того, на чутливість бактерій впливають стійкість до коліцинів і імунітет до дії коліцина, ідентичного тому, що продукується самою клітиною. Коліциночутливість визначається в 90-95% шигел незалежно від видової приналежності, але ця ознака не є такою стабільною, як здатність продукувати коліцини. Зміна спектра коліциночутливості частіше відмічається серед культур, схильних до дисоціації (S.sonnei). У зв'язку з цим необхідно типувати свіжовиділені культури, не залишаючи їх на тривале зберігання.
Культури з вогнища досліджуються одночасно. Визначення чутливості проводиться на 15 еталонних культурах, що продукують визначені коліцини (таблиця 4).
Таблиця 4
Паспортні дані еталонних коліциногенних штамів з колекції Фредеріка
№№ з/п
Назва штаму
Тип коліцина, що продукується
E.coli
Са-7
V+m
Е.coli
Са-18
B
E.coli
Са-23
D
Е.freundi
Са-31
A
E.coli
Са-38
E+1
E.coli
Са-42
F
E.coli
Са-53
I
E.coli
Са-58
H
E.coli
Са-62
J+I
E.coli
К-235
K
S.boudii
Р1
S1
S.sonnei
Р9
S3+1
S.dispar
Р14
S5
S.dispar
Р15*
S4
E.coli
Са-46
G
* Культури S.dispar P15 на поживних середовищах при зберіганні утворюють пігмент жовтого кольору, інтенсивність якого збільшується до яскраво-апельсинового кольору
При одержанні колекції еталонних культур Фредеріка необхідно раз 5-6 пропасирувати їх через звичайний МПБ. Після чого визначити біохімічну характеристику і біологічну (гальмівну) дію на універсальних коліциночутливих індикаторних культурах – Е.coli K-12 ROW (її субкультурою є індикатор Аббота і Шеннона), Е.coli φ і Е.coli B.
Чутливість цих індикаторних культур приведена в таблиці 5. Перевірку еталонних Е.coli проводять не рідше 1 рази в 2-3 місяця.
Таблиця 5
Паспортні дані індикаторних культур з колекції Фредеріка
№№ з/п
Назва штаму
Примітка
E.coli К-12, ROW
Побачили розбіжність з офіційним текстом?