Статус Проект Порядок розслідування, обліку і проведення лабораторних досліджень у випадках харчових отруєнь. Інструкція

16.3. Фаготипування S.aureus

При епідеміологічному вивченні стафілококових інтоксикацій застосовують метод фаготипування стафілококів. Типуванню підлягають усі S.aureus, виділені з інкримінованого продукту, від потерпілих, зі змивів з інвентарю, устаткування та ін. Для цих цілей використовують міжнародний набір типових бактеріофагів. Дослідження проводять за методикою, що наведена в Інструкції до набору.

Біологічні дослідження Біологічні дослідження проводять:

для вивчення здатності виділених S.aureus утворювати ентеротоксин на поживних середовищах;

для виявлення наявності стафілококового ентеротоксина в інкримінованому продукті. В якості експериментальних тварин можуть бути використані кошенята (1,5 – 2-місячні) і дорослі кішки.

Біологічна проба на кошенятах. Досліджуваний продукт або п’ятидобову молочну культуру виділеного стафілокока (15 – 20 см³) згодовують кошенятам натще. Якщо кошенята не їдять даний продукт, варто приготувати суспензію продукту в дистильованій воді (1:1), добре гомогенізувати і споїти по 15 – 20 см³ кожному кошеняті за допомогою піпетки або ложки. У досліді повинно бути 2 – 3 кошенята. Позитивною реакцією вважають блювоту, що наступила через 30 – 60 хвилин, іноді спостерігаються понос і загальна прострація. Блювота, що з'являється через 5 – 10 хвилин, неспецифічна. Спостереження за кошенятами ведуть протягом 4 – 5 годин. Якщо за цей період кошенята не реагують, біологічна проба вважається негативною.

Біологічна проба на кішках. Ентеротоксичність визначають шляхом внутрішньовенного введення матеріалу кішкам. Цей метод внутрішньовенного введення матеріалу дорослим кішкам досить чуттєвий. Недоліком методу є обмеженість його застосування для виявлення ентеротоксина безпосередньо в продуктах. Для виявлення ентеротоксичності культур користуються 0,75% агаром на телячому бульйоні або бульйоні Хоттінгера з 0,25% глюкози рН 7,4. Чашки, засіяні культурами стафілококів, поміщають в ексикатор з 20% вуглекислотою і інкубують 48 годин при 37 ºС.

Щоб одержати в ексикаторі 20% вуглекислоти, насипають на дно останнього двовуглекислу соду з розрахунку 1 г соди на кожен літр об’єму ексикатора, завантажують його чашками і, трошки відкривши кришку, наливають піпеткою Мору 10% соляну кислоту безпосередньо на соду (на 1 г соди – 8-9 мл кислоти). Після додавання кислоти кришку ексикатора швидко накривають і притирають.

Після інкубації чашки виймають і на поверхню агару наливають 10 см³ фізіологічного розчину, агар подрібнюють до рівномірної кашкоподібної консистенції і залишають при кімнатній температурі на 2 години. Екстракт центрифугують до одержання прозорого шару, що відсмоктують, прогрівають у киплячій водяній бані протягом 30 хв. і вводять кішкам у кількості 0,5 см³ на 1 кг ваги тіла у вену вуха або в стегнову вену.

Наявність блювоти і поносу або тільки блювоти, що наступила в терміни від 30 хвилин до 3 годин вказує на присутність ентеротоксина. Кожну кішку можна використовувати для цих цілей 3 – 4 рази. При одержанні негативних результатів у кішки, що раніше була використана для аналогічних визначень, необхідна перевірка на кішці, що не була в досліді.

За допомогою методу внутрішньовенного введення кішкам вирішувати питання про наявність ентеротоксина в харчовому продукті потрібно з великою обережністю. З продукту, досліджуваного на наявність ентеротоксина, готують суспензію в стерильному фізіологічному розчині таким чином, щоб при наступному центрифугуванні одержати достатню кількість надосадової рідини для постановки біологічної проби. Як контроль необхідно одержати негативний результат у кішки, призначеної для досліду, при введенні надосадової рідини, отриманої з доброякісного тотожного продукту, підготовленого тим же способом, що і досліджуваний зразок.

17. БАКТЕРІЇ РОДУ ENTEROCOCCUS

17.1. Загальні положення

Ентерококи відносяться до роду Enterocococcus, 17 групи за Bergey, 1994 “Грамнегативні коки” Вони є мешканцями кишечнику людини, і розглядаються як умовно-патогенні мікроорганізми, що має санітарно-показове значення. У середині роду виділено 11 видів, які викликають інфекційні процеси частіше всього в асоціаціях з кишковою паличкою, протеєм, S.aureus. Найчастіше ураження людей викликають Е. faecalis, Е. faecium, Е. durans.

Для ентерококів характерні такі основні властивості.

Ентерококи досить повільно ростуть на звичайних поживних, середовищах тому для більш інтенсивного росту в середовища додають вуглеводи (глюкозу, лактозу) багатоатомний спирт – манітол, дріжджові препарати (аутолізати, діалізати, екстракти), амінокислоти (аргінін, аланін і ін.), вітаміни (рибофлавін, нікотинова кислота й ін.)

Ріст ентерококів досягає максимуму через 36–48 годин при 37 ºС. Температурні межі росту коливаються від 10 ºС до 50 ºС у залежності від виду ентерококів.

На щільних поживних середовищах ентерококи утворюють дрібні округлі колонії. При рості в рідких середовищах вони спричиняють дифузне помутніння й утворення аморфного осаду.

Ентерококи стійкі до багатьох барвників (кристалвіолету, фуксину та ін.) і антибіотиків (пеніциліну, стрептоміцину, поліміксину тощо).

У мазках з рідких середовищ ентерококи розташовуються у вигляді коротких і довгих ланцюжків, у щільних – у вигляді диплококів або скупчень коків. Фарбуються за Грамом позитивно. Спор і капсул не утворюють. Як правило, нерухомі, але описані і рухливі варіанти з 1 – 4 джгутиками. Різко поліморфні. Поліморфізм особливо виражений у культур, виділених з харчових продуктів.

Серологічно ентерококи являють собою досить однорідну групу мікроорганізмів, що володіє полісахаридним антигеном «Д» по Ленсфільд. У штамів Е. faecalis і його варіантів відзначена наявність видового антигену, що по своїй хімічній природі є полісахаридам.

Для всієї групи ентерококів характерна стійкість до 40% жовчі, 6,5% хлористого натрію і високого рН (9,6 – 10,2). Усі вони не ферментують рафінозу і не розкладають перекис водню (Н₂О₂), тому що не виробляють фермент – каталазу.

У свежовиділеніих штамів ентерококів відзначаються протеолітичні властивості. Саме ті ентерококи, що володіють протеолітичними ферментами, можуть зумовити харчове отруєння при вмісті 10⁶ і більше КУО в 1 г/см³ продукту.

Ентерококи є облігатними представниками нормальної мікрофлори кишечнику людини і теплокровних тварин, у зв'язку з чим дуже широко поширені в довкіллі, у тому числі й у різних харчових продуктах, але особливо часто їх виявляють у молочних продуктах. Органолептика продуктів залежить від виду ентерокока, який забруднює продукт. Так, штами Е. faecium не змінюють органолептику м'ясних продуктів, а молоко згортають і додають йому приємний смак кисломолочного продукту. Штами ж ентерококів, що можуть викликати харчові отруєння додають продуктам неприємний гіркий смак і ослизнення, але органолептичні зміни в продуктах настають, коли в них міститься більш ніж 10⁶ клітин ентерококів у 1 грамі.

При лабораторній діагностиці ентерококових харчових отруєнь дослідженню варто піддавати продукти, запідозрені як причина захворювання і випорожнення потерпілих.

17.2. Бактеріологічні дослідження

Третій день Через 48 годин посіви переглядають. Типові колонії ентерококів мають округлу форму, рівні краї, блискучу поверхню, діаметр 1,5 – 2 мм і бордове фарбування на світло-рожевому тлі середовища Ентерококагар або сіре з зоною протеолізу на середовищі . Підраховують усі типові колонії і число їх перераховують на 1 г/см³ продукту. 3 – 5 колоній відсівають на скошений агар для подальшої ідентифікації. На скошеному агарі посіви культивують при (37±1) ºС протягом 24 годин.

Четвертий день З культури на скошеному агарі готують мазки і фарбують їх за Грамом. Одночасно визначають каталазну активність штамів. Для чого на очищене, знежирене скло наносять краплю 1% водяного розчину перекису водню і в ній розтирають петлю культури, якщо пухирці газу не виділяються, значить реакція негативна. Грампозитивні, каталазонегативні диплококи вивчають по тестам представленим у таблиці 30. Посів на середовище з 2,3,5-ТТХ не роблять, тому що ця речовина входить у середовище Ентерококагар. Усі посіви поміщають у термостат при (37±1) ºС на 24 години.

Таблиця 30

Диференційні ознаки ентерококів патогенних для людини

Диференціальні ознаки

Види ентерококів

Е. faecalis

E. faecium

E. durans

Редукція телуриту калію

+

–

–

Редукція 2,3,5-ТТХ

+

–

–

Гемоліз







Ферментація

сорбіту

+

–

–

маніта

+

+

–

рафінози

–

–

–

рамнози

+

+,-

-

сахарози

+

+,-

-

арабінози

-

+

-

гліцерину

+

+

-

П’ятий день Через 24 години посіви переглядають і реєструють результати.

Діагноз ентерококового харчового отруєння підтверджується, якщо в інкримінованому продукті і випорожненнях хворих були виявлені протеолітичні штами ентерококів у кількостях більш ніж 10⁶ у 1 г/см³ продукту і більш ніж 10⁴ у грамі калу при типовій клінічній картині захворювання.

18. СПОРОНОСНІ АНАЕРОБИ – C. botulinum

18.1. Загальні положення

Ботулізм – важке харчове бактеріальне отруєння з високою летальністю. В усіх країнах ботулізм пов'язаний, головним чином, із продуктами домашнього приготування, заготовленими про запас. Загальноприйняті в домашніх умовах способи обробки харчових продуктів, такі як консервування в банках, копчення, маринування, соління та ін., не приводять до знищення збудників ботулізму і їх спор і при тривалому збереженні в цих продуктах може утворитися токсин.

Збудники ботулізму широко поширені в природі. Вони виявляються у ґрунті, у гної, на фруктах і овочах, у рибі, у фуражі, в екскрементах теплокровних тварин. Широке поширення збудників ботулізму в ґрунті неминуче веде до потрапляння цих мікробів на овочі і фрукти, а також до обсіменіння різної сировини, що йде для приготування консервів, ковбас і інших продуктів. Інтенсивність зараження залежить від санітарних і технологічних умов обробки і збереження продуктів.

Сьогодні відомо 8 серологічних варіантів ботулінічного токсину А, В, C1, C2, D, Е, F, G. Для людини особливо небезпечними є серологічні варіанти А, В, Е та F, а серовари ботулотоксина С та D визначались лише в поодиноких випадках. C.botulinum типів – дуже близькі за морфологією, культуральним властивостям і дії їх токсинів на організм людини і тварин. Усі вони дають однакову клінічну картину хвороби. Зазначені типи ботулінічного мікроба відрізняються антигенними властивостями токсинів, що вони продукують. Це означає, що токсин кожного типу нейтралізується сироваткою того ж типу.

По морфології C.botulinum являють собою невеликі палички довжиною 4 – 9 ммк і шириною 0,6 – 0,9 ммк з закругленими кінцями, капсул не утворюють, рухливі, мають від 4 до 35 джгутиків. C.botulinum утворюють субтермінальні або термінальні спори; палички зі спорою мають вид тенісної ракетки. Легко фарбуються різними аніліновими фарбами. Молоді клітки фарбуються за Грамом позитивно. При старінні культури (через 4–5 діб росту) палички фарбуються грамнегативно.

Збудники ботулізму – облігатні анаероби, ростуть без доступу повітря, тому звичайно розмножуються й утворюють токсин усередині великих шматків риби, шинки, ковбаси, або в герметично закритих банках консервів. Установлено, що збудники ботулізму типу Е, а також непротеолітичні штами типу В і деякі штами типу F утворюють на поживних середовищах та у харчових продуктах крім токсину і нетоксичний попередник токсину – протоксин, що, не вбиваючи мишей при парентеральном уведенні, виявляє свою біологічну активність при попаданні в шлунково-кишковий тракт людини і тварин внаслідок впливу на нього протеолітичних ферментів.

При додаванні протеолітичних ферментів (трипсину, панкреатину) in vitro також відбувається активація протоксина і перехід його у токсин. Цей феномен варто враховувати при проведенні лабораторної діагностики ботулізму.

Нерідко консервні банки, куди разом із продуктами попадає і C.botulinum, виявляються бомбажними за рахунок утворення мікробом газу, однак часто при наявності мікробів ботулізму і ботулінічних токсинів харчові продукти виглядають зовсім доброякісними і консервні банки не дають “бомбажу”. Іноді відзначається специфічний запах прогірклої олії. Найбільш придатною температурою для росту C.botulinum типів A, B, C, D є температура 35 ºС, для типів E, F – 28, 30 ºС.

Ботулінічні токсини досить стійкі до температурних впливів. Токсин іноді руйнується тільки при кип'ятінні протягом 10-15 хвилин і не руйнується в шлунково-кишковому тракті під впливом травних ферментів. Лабораторна діагностика ботулізму має на меті виявлення ботулінічного токсину або C.botulinum в харчових продуктах, що викликали отруєння, а також у матеріалах, узятих від хворого або в органах із трупів. При цьому важливо встановити не тільки присутність токсину або мікроба, але і визначити їх тип, з метою підтвердження клінічного діагнозу і призначення правильного лікування.

18.2. Бактеріологічні дослідження

Перший день Проби, що надійшли в лабораторію, досліджують одночасно у двох напрямках: проводять виявлення ботулінічних токсинів і C.botulinum. Дві третини, попередньо підготовленої, як зазначено вище, проби призначають для виявлення ботулінічних токсинів, одна третина – для посівів з метою виявлення C.botulinum.

Частину проби, що досліджують на наявність токсинів, витримують протягом 1–1,5 годин при кімнатній температурі для екстрагування токсинів, фільтрують через ватно-марлевий фільтр або центрифугують при 2500 – 3000 об/хв. протягом 15–20 хвилин. Фільтрування через тальковий фільтр неприпустимо, тому що тальк сорбує на собі ботулінічні токсини.

Для виявлення ботулінічних токсинів з отриманими фільтратами або надосадовою рідиною ставлять реакцію нейтралізації токсину антитоксичною сироваткою (РН).

18.2.1. Виявлення ботулінічних токсинів у реакції нейтралізації

Дослідженню на наявність токсину можуть підлягати промивні води шлунку, залишки їжі з шлунку, сеча і випорожнення хворого, секційний матеріал (2-3 шматочка по 5-10 грамів з серця, печінки, селезінки, нирок, головного мозку, стінки шлунку, товстого та тонкого кишечнику), кров з серця, харчові продукти, фураж тощо.

З секційного матеріалу (найбільш часто токсин знаходять у печінці), згустків крові, вмісту кишечнику та з випорожнень роблять екстракти. Екстрагування токсинів з продуктів, що містять повірену сіль, проводять дистильованою водою. Настоювання досліджуваного матеріалу проводять протягом 1-2 годин. Після чого фільтрують через вату. Отримана після фільтрації рідина, а також сироватки крові, сеча можуть бути використані для реакції нейтралізації.

Для визначення токсину в харчових продуктах, враховуючи можливість гніздного розташування його, проби матеріалів відбирають по 20-25 г у місцях, найбільш підозрілих за органолептичними властивостями, гомогенізують і заливають подвійним об’ємом фізіологічного розчину. Після 2-годинної експозиції екстракт центрифугують і ставлять РН.

Примітка. Враховуючи, що значна частина токсину типу Е продукується у вигляді протоксину, що активізується під дією травних ферментів, для виявлення токсину типу Е екстракт з продуктів перед постановкою РН рекомендується активізувати панкреатином або трипсином (1 см³ розчину ферментів на 10 см³ екстракту). Суміш екстракту з ферментом витримують при температурі (37±1) ºС протягом 2 годин.

Використовуються сухі типоспецифічні діагностичні ботулінічні сироватки. В 1 см³ типоспеціфічної сироватки типу А міститься не менше 200 МО, типу B не менше 100 МО, типу C – не менше 150 МО, типу E – не менше 200 МО, типу F – не менше 50 МО антитоксину.

Заборонено користатися для цілей діагностики лікувальними протиботулінічними сироватками.

Для виявлення токсинів для кожної проби використовують мишей вагою 16 – 18 грамів. У зв'язку з тим, що в досліджуваному матеріалі може бути один або кілька типів ботулінічних токсинів, попередню реакцію ставлять із сумішшю сироваток діагностичних ботулінічних типів A, B, C, E, F. Доза сироватки, що рекомендують для РН, як правило, забезпечує нейтралізацію гомологічного токсину в досліджуваній пробі, тому що в організмі і виділеннях хворих, а також в екстрактах з харчових продуктів, дуже сильні токсини майже не зустрічаються.