Продовження таблиці 26

Ознаки

Види вібріонів

V.parahae-molyticus

V.alginoly-ticus

V.vulnifi-cus

V.mimi-cus

Наявність:

желатинази

+

+

+

+

лецитинази

+

+

+

+

каталази

+

+

+

+

??-галактозидази (ONPG)

-

-

+

+

уреази

-

-

-

-

Редукція нітратів в нітрити

+

+

+

+

Рухливість (монотрихі)

+

+

+

+

Примітка: + позитивний; (+) повільний; - негативний

Таблиця 27

Диференціальні ознаки галофільних вібріонів, патогенних для людини

Найменування тестів

V.parahemolyticus

V.alginolyticus

V.vulnificus

Розщеплення:

лактози

-

-

+

сахарози

-

+

-

маниту

+

+

??

Утворення ацетилметилкарбинолу

-

+

-

Наявність ??-галактозидази (ONPG)

-

-

+

Ріст в пептонній воді:

з 7% NaCl

+

+

-

з 10% NaCl

+

Феномен роїння

??

??

-

Примітка: + позитивний; - негативний; ?? рідко

Другий день

1. Пересів матеріалу з поверхні 2-го середовища збагачення на лужний агар та бакагар Плоскірева.

2. Перегляд чашок з первинними посівами. Підозрілі на галофільні вібріони колонії, а також лактозонегативні колонії з середовища Плоскірева відсівають в ПВ без NaCl і тією ж петлею (без обпалювання) – в глюкозо-лактозне середовище Ресселя (уколом в стовпчик та штрихом по поверхні).

Третій день

1. Вивчення посівів з 2-го середовища збагачення та виділення підозрілих культур проводять за другим днем дослідження.

2. Облік характеру росту культур на середовище Ресселя та ПВ без NaCl для подальшого дослідження на галофільні вібріони. відбирають культури які не ростуть на ПВ без NaCl, розщеплюють глюкозу без утворення газу та мають позитивну реакцією на індолфенолоксидазу на папері. Роблять їх мікроскопію в пофарбованих за Грамом препаратах і підрахунок з наступним перерахуванням на продукту за загальноприйнятою методикою. Культури з грамнегативними поліморфними паличками (трошки вигнутими, прямими або овоїдними) продовжують досліджувати.

3. Відібрані культури засівають на такі середовища, що містять 3% NaCl:

  • 0,3% та 1,5% лужні агари;
  • Хью-Лейфсона з глюкозою, Гіса з сахарозою, манозою, арабінозою, лактозою, манітом, Кларка;
  • з амінокислотами;
  • бульйон з індикаторними папірцями на індол та сірководень.

При необхідності визначення вірулентності виділених галофілів за їх гемолітичним властивостям проводять пересів культур петлею із сольового бульйону на сектора добре підсушеної чашки з кров'яним сольовим агаром (середовище Wagatsuma). Інкубують при (35??1) ºС 18 – 20 годин. Вірулентні штами викликають на середовищі гемоліз еритроцитів.

Четвертий день

1. Облік результатів ідентифікації, визначення виду та біотипу виділених культур з 1-го середовища збагачення. Видача попередньої відповіді.

2. Культури, ізольовані з 2-го середовища збагачення, досліджують за схемою третього дня дослідження.

П’ятий день

1. Облік результатів ідентифікації, визначення виду та біотипу виділених культур з 2-го середовища збагачення. Видача заключної відповіді.

Критеріями діагностики захворювань, викликаних V. рarahaemolyticus, є виявлення їх у випорожненнях хворих та підозрюваному продукті в кількості 106 і більш живих клітин у 1 г/см3.

14. БАКТЕРІЇ РОДУ LISTERIA – listeria monocytogenes

14.1. Загальні положення

В останні роки бактерії роду лістерій включені в перелік мікроорганізмів, які викликають важкі форми харчових отруєнь з різко вираженими ознаками, ураженням нервової системи типу менінгіту, менінгоенцефаліту або енцефаліту.

Род Listeria за Визначальником бактерій Берджі (9 видання) відноситься до 19 групи мікроорганізмів – грампозитивні неспороутворюючі палички правильної форми і включає 7 видів. В патології людини має значення два види: L. monocytogenes та L. ivanovii (рідко). Мікроорганізми, що відносяться до цього роду, являють собою невеликі коковидні грампозитивні палички, з тенденцією до утворення ланцюжків з 3-5 або більше клітин (у гладкій формі). У шорсткуватій R-формі подовжені або нитковидні. Розмір лістерій залежить від умов культивування, температури вирощування та інтенсивності посіву. Зустрічаються вигнуті форми мікроорганізму з потовщенням на кінцях, іноді з'єднаних у вигляді римської цифри V. Спор та капсул не утворюють. Однак, при низьких температурах вирощування можуть оточуватись капсулоподібною речовиною. Лістерії добре фарбуються аніліновими фарбниками. Молоді культури грампозитивні, однак по мірі старіння зустрічаються грамнегативні палички. Стійки до метиленової сині, чутливі до генціан-, кристалвіолету, фуксину, що використовується для їх диференціації.

Мають один термінально розташований джгутик, іноді 3 - 4 бокових. Лістерії рухомі при температурі (20-25) ºС. Ця здатність збільшується при тривалих пересівах культури. S-форми колоній лістерій – дрібні, випуклі, з рівним краєм, зернистою структурою, прозорі, безкольорові з голубуватим відтінком, в падаючому світлі – сірувато-молочного кольору, діаметром 0,5-.

R-форми утворюються при довготривалому культивуванні; у колонії з’являються одно- або двосторонні бокові вирости, довжина яких іноді перевищує діаметр колонії. Колонії стають мутними, майже білими, але зберігають гладку блискучу поверхню. По краю з’являється плоский валик.

При 37 ºС джгутики втрачаються і з ними втрачається рухомість.

Лістерії є факультативними анаеробами, оптимальна температура вирощування (30-37) ºС, однак можуть розмножуватись і при більш низьких температурах. Ростуть на звичайних поживних середовищах, більш пишний ріст спостерігається при вирощуванні на середовищах з додаванням сироватки. Однак оптимальними для них є глюкозо- (1%), гліцерино- (2%) сироваточний (3-5%) агар. На простих поживних середовищах (МПА, МПБ) з додаванням 1% глюкози ріст появляється через 24 години, іноді буває затримка його при виділенні лістерій з клінічного матеріалу. Добові колонії на чашках з МПА дрібні, круглі, слабо випуклі, з рівним краєм, напівпрозорі, ледь помітні неозброєним оком, через 48 годин – розмір колонії достигає до 1-. При густому посіві на скошеному агарі через добу спостерігається ріст у вигляді тонкого, напівпрозорого, сіруватого нальоту, який видно неозброєним оком.

Слід пам'ятати про нерівномірність росту культури – на фоні більш прозорого суцільного росту часто бувають невеликі білуваті вкраплення, що імітує ріст сторонніх колоній.

На МПБ культура дає слабке рівномірне помутніння, без плівки, на дні осад, який при струшуванні підіймається у вигляді “косички”.

Лістерії каталазопозитивні, ферментують з утворенням кислоти без газу глюкозу, мальтозу, рамнозу, левульозу, ескулін та саліцін; уповільнено сахарозу, гліцерин, лактозу, не ферментують маніт, дульцит, арабінозу, рафінозу, сорбіт. Індол не утворюють, желатину не розріджують, сірководень не утворюють на звичайних поживних середовищах, однак при вирощуванні на середовищах з амінокислотами (бульйон Хоттінгера) можуть утворювати його. Сечовину не гідролізують, в реакціях MR та VP – позитивні. На середовищах з глюкозою, левульозою, саліцином лістерії мають – типовий "кислуватий" запах, що нагадує запах сиру або молочної сироватки. На кров'яному агарі через 24 години утворюють маленькі (до в діаметрі) голубувато-білі колонії, з вузькою зоною β-гемолізу навкруги.

Лістерії стійки до NaCl, зберігають життєздатність у 18-24% розчинах його.

Лістерії патогенні для багатьох видів ссавців, в тому числі гризунів, комахоїстивних, а також птиць.

З лабораторних тварин найбільш чутливими є кролі, морські свинки та білі миші. При внутрішньо мозковому зараженні білих мишей загибель настає на 1-4 день з ознаками сепсису, при підшкірному та внутрішньом'язовому – на 3-14 з характерним ураженням внутрішніх органів (крапкові некротичні вузлики).

Лістерії стійкі у довкіллі, ростуть при широкому діапазоні температур (3-42 ºС), рН (від <5,5 до 9,5). В ґрунті при помірній та низькій температурі зберігаються місяцями, а при сприятливих умовах можуть розмножуватися. На зерні при низьких температурах зберігаються до 3 років. Бактерії інтенсивно розмножуються у молоці, м’ясі, овочевих салатах, свіжих фруктових соках, навіть при низьких температурах (4-6) ºС. Витримують прогрівання при 58 ºС, при 70 ºС вони гинуть через 20-30 хв., при 100 ºС через 3-5 хв. Чутливі до дезінфекційних засобів.

Факторами поширення лістеріозу, як правило, є продукти тваринного походження м'ясо, птиця та продукти з них. Переважає при цьому м'ясо птахів. Інфікованими можуть бути жирові продукти тваринного походження, крім топлених жирів. Молоко, молочні продукти, сири посідають значне місце в поширенні лістеріозу.

Можливе поширення інфекції через рибу, устриці, жаби, молюски, креветки тощо. Інфікованими можуть виявитися продукти рослинного походження (овочі, фрукти) та холодні блюда з них, що не підлягають термічній обробці (салати, супи).

14.2. Бактеріологічні дослідження

Другий день

Через 18-24 години переглядають посіви. З підозрілих колоній готують мазки і фарбують по Граму. Характерну за морфологічними та тінкторіальними властивостями культуру пересівають на 2-3 пробірки зі скошеним МПА для отримання чистої культури.

Переглядають характер росту на середовищі збагачення і роблять висів на чашки Петрі з глюкозо-гліцеріно-сироваточним і кров'яним агарами. Характер росту на рідких та щільних поживних середовищах викладено у загальному положенні.

Якщо на чашках підозрілі колонії відсутні, відповідь видають тільки після результатів висівів з середовищ збагачення.

В більшості випадків ріст лістерій відбувається на 2-3-день.

Третій день

Проводять ідентифікацію культури що виросла на скошеному МПА. Підтверджуючі тести родової і видової ідентифікації включають фарбування за Грамом, визначення рухливості виділених на агаризованих середовищах типових по фізіологічних і морфологічних ознаках культур, їх здатності відновлювати нітрати до нітритів, зброджувати рамнозу, ксилозу і маніт, здатності до гідролізу лецетину на середовищі з активованим вугіллям, а також визначення наявності ??-гемолізу на кров'яному агарі і диференціацію L. monocytogenes від інших гемолизуючих лістерій у САМР-тесті з контрольними штамами Staphylococcus aureus і Rhodococcus equi. При необхідності ставлять біологічну та керато-кон'юнктивальну проби та імунофлюоресценцію

Для визначення належності виділених мікроорганізмів до роду Listeria отримані на середовищах культивування чисті культури мікроскопують за Грамом, визначають наявність у них каталази, рухливість при двох температурах інкубації – 22 і 37 ºС, здатність до ферментації маніту і ставлять реакцію редукції нітратів.

Фарбування за Грамом. Бактерії роду Listeria є грампозитивними тонкими короткими паличками, спор не утворюють.

Рухливість культур визначають посівом уколом у середовище для визначення рухливості лістерій і інкубації при двох температурах – (25±1) ºС і (37±1) ºС протягом 48-72 год.

Бактерії роду Listeria рухливі при (20-25) ºС (утворюють характерний, схожий на парасольку, ріст навколо лінії уколу) і нерухомі або слабо рухомі при (35-37) ºС.

Утворення каталази. Реакцію ставлять з охолодженої до кімнатної температури добовою культурою на стерильному предметному склі. Ізольовану колонію, узяту з поверхні поживного середовища скляною паличкою або платиновою петлею розтирають на склі і піпеткою наносять краплю 3 % розчину перекису водню. При позитивній реакції через 30-60 сек. на склі з'являються пухирці газу. Паралельно ставлять контрольну пробу.

Бактерії роду Listeria є каталазопозитивними.

Гемолітична активність. β-гемоліз визначається шляхом посіву чистих культур на кров'яний агар, який витримують добу в термостаті при 37 ºС і 24 години при температурі (20-25 º) С.

Здатність зброджувати вуглеводи. Чисту культуру пересівають на середовища Гиса. Посіви інкубують 7 діб при (37±1) ºС, наявність ферментативної активності у відношенні вуглеводів визначають по зміні кольору середовищ за рахунок утворення кислоти.

Більшість бактерій роду Listeria не утилізують маніт (за винятком L. grayi та L. grayi subsp. murrayi).

Визначення нітрат-редукції проводять за ГОСТ 10444.8-88. Бактерії роду Listeria не відновлюють нітрати до нітритів (за винятком L. grayi і L. grayi subsp. murrayi).

Виявлення в посівах грампозитивних коротких тонких паличок, каталазопозитивних, що не відновлюють нітрати до нітритів, не утилізують маніт, рухливі при (25±1) ºС і нерухомі при (37±1) ºС, указує на належність виділених культур з до роду Listeria.