Статус Проект Порядок розслідування, обліку і проведення лабораторних досліджень у випадках харчових отруєнь. Інструкція

Мають один термінально розташований джгутик, іноді 3 - 4 бокових. Лістерії рухомі при температурі (20-25) ºС. Ця здатність збільшується при тривалих пересівах культури. S-форми колоній лістерій – дрібні, випуклі, з рівним краєм, зернистою структурою, прозорі, безкольорові з голубуватим відтінком, в падаючому світлі – сірувато-молочного кольору, діаметром 0,5-2 мм.

R-форми утворюються при довготривалому культивуванні; у колонії з’являються одно- або двосторонні бокові вирости, довжина яких іноді перевищує діаметр колонії. Колонії стають мутними, майже білими, але зберігають гладку блискучу поверхню. По краю з’являється плоский валик.

При 37 ºС джгутики втрачаються і з ними втрачається рухомість.

Лістерії є факультативними анаеробами, оптимальна температура вирощування (30-37) ºС, однак можуть розмножуватись і при більш низьких температурах. Ростуть на звичайних поживних середовищах, більш пишний ріст спостерігається при вирощуванні на середовищах з додаванням сироватки. Однак оптимальними для них є глюкозо- (1%), гліцерино- (2%) сироваточний (3-5%) агар. На простих поживних середовищах (МПА, МПБ) з додаванням 1% глюкози ріст появляється через 24 години, іноді буває затримка його при виділенні лістерій з клінічного матеріалу. Добові колонії на чашках з МПА дрібні, круглі, слабо випуклі, з рівним краєм, напівпрозорі, ледь помітні неозброєним оком, через 48 годин – розмір колонії достигає до 1-2 мм. При густому посіві на скошеному агарі через добу спостерігається ріст у вигляді тонкого, напівпрозорого, сіруватого нальоту, який видно неозброєним оком.

Слід пам'ятати про нерівномірність росту культури – на фоні більш прозорого суцільного росту часто бувають невеликі білуваті вкраплення, що імітує ріст сторонніх колоній.

На МПБ культура дає слабке рівномірне помутніння, без плівки, на дні осад, який при струшуванні підіймається у вигляді “косички”.

Лістерії каталазопозитивні, ферментують з утворенням кислоти без газу глюкозу, мальтозу, рамнозу, левульозу, ескулін та саліцін; уповільнено сахарозу, гліцерин, лактозу, не ферментують маніт, дульцит, арабінозу, рафінозу, сорбіт. Індол не утворюють, желатину не розріджують, сірководень не утворюють на звичайних поживних середовищах, однак при вирощуванні на середовищах з амінокислотами (бульйон Хоттінгера) можуть утворювати його. Сечовину не гідролізують, в реакціях MR та VP – позитивні. На середовищах з глюкозою, левульозою, саліцином лістерії мають – типовий "кислуватий" запах, що нагадує запах сиру або молочної сироватки. На кров'яному агарі через 24 години утворюють маленькі (до 1 мм в діаметрі) голубувато-білі колонії, з вузькою зоною β-гемолізу навкруги.

Лістерії стійки до NaCl, зберігають життєздатність у 18-24% розчинах його.

Лістерії патогенні для багатьох видів ссавців, в тому числі гризунів, комахоїстивних, а також птиць.

З лабораторних тварин найбільш чутливими є кролі, морські свинки та білі миші. При внутрішньо мозковому зараженні білих мишей загибель настає на 1-4 день з ознаками сепсису, при підшкірному та внутрішньом'язовому – на 3-14 з характерним ураженням внутрішніх органів (крапкові некротичні вузлики).

Лістерії стійкі у довкіллі, ростуть при широкому діапазоні температур (3-42 ºС), рН (від <5,5 до 9,5). В ґрунті при помірній та низькій температурі зберігаються місяцями, а при сприятливих умовах можуть розмножуватися. На зерні при низьких температурах зберігаються до 3 років. Бактерії інтенсивно розмножуються у молоці, м’ясі, овочевих салатах, свіжих фруктових соках, навіть при низьких температурах (4-6) ºС. Витримують прогрівання при 58 ºС, при 70 ºС вони гинуть через 20-30 хв., при 100 ºС через 3-5 хв. Чутливі до дезінфекційних засобів.

Факторами поширення лістеріозу, як правило, є продукти тваринного походження м'ясо, птиця та продукти з них. Переважає при цьому м'ясо птахів. Інфікованими можуть бути жирові продукти тваринного походження, крім топлених жирів. Молоко, молочні продукти, сири посідають значне місце в поширенні лістеріозу.

Можливе поширення інфекції через рибу, устриці, жаби, молюски, креветки тощо. Інфікованими можуть виявитися продукти рослинного походження (овочі, фрукти) та холодні блюда з них, що не підлягають термічній обробці (салати, супи).

14.2. Бактеріологічні дослідження

Другий день Через 18-24 години переглядають посіви. З підозрілих колоній готують мазки і фарбують по Граму. Характерну за морфологічними та тінкторіальними властивостями культуру пересівають на 2-3 пробірки зі скошеним МПА для отримання чистої культури.

Переглядають характер росту на середовищі збагачення і роблять висів на чашки Петрі з глюкозо-гліцеріно-сироваточним і кров'яним агарами. Характер росту на рідких та щільних поживних середовищах викладено у загальному положенні.

Якщо на чашках підозрілі колонії відсутні, відповідь видають тільки після результатів висівів з середовищ збагачення.

В більшості випадків ріст лістерій відбувається на 2-3-день.

Третій день Проводять ідентифікацію культури що виросла на скошеному МПА. Підтверджуючі тести родової і видової ідентифікації включають фарбування за Грамом, визначення рухливості виділених на агаризованих середовищах типових по фізіологічних і морфологічних ознаках культур, їх здатності відновлювати нітрати до нітритів, зброджувати рамнозу, ксилозу і маніт, здатності до гідролізу лецетину на середовищі з активованим вугіллям, а також визначення наявності -гемолізу на кров'яному агарі і диференціацію L. monocytogenes від інших гемолизуючих лістерій у САМР-тесті з контрольними штамами Staphylococcus aureus і Rhodococcus equi. При необхідності ставлять біологічну та керато-кон'юнктивальну проби та імунофлюоресценцію

Для визначення належності виділених мікроорганізмів до роду Listeria отримані на середовищах культивування чисті культури мікроскопують за Грамом, визначають наявність у них каталази, рухливість при двох температурах інкубації – 22 і 37 ºС, здатність до ферментації маніту і ставлять реакцію редукції нітратів.

Фарбування за Грамом. Бактерії роду Listeria є грампозитивними тонкими короткими паличками, спор не утворюють.

Рухливість культур визначають посівом уколом у середовище для визначення рухливості лістерій і інкубації при двох температурах – (25±1) ºС і (37±1) ºС протягом 48-72 год.

Бактерії роду Listeria рухливі при (20-25) ºС (утворюють характерний, схожий на парасольку, ріст навколо лінії уколу) і нерухомі або слабо рухомі при (35-37) ºС.

Утворення каталази. Реакцію ставлять з охолодженої до кімнатної температури добовою культурою на стерильному предметному склі. Ізольовану колонію, узяту з поверхні поживного середовища скляною паличкою або платиновою петлею розтирають на склі і піпеткою наносять краплю 3 % розчину перекису водню. При позитивній реакції через 30-60 сек. на склі з'являються пухирці газу. Паралельно ставлять контрольну пробу.

Бактерії роду Listeria є каталазопозитивними.

Гемолітична активність. β-гемоліз визначається шляхом посіву чистих культур на кров'яний агар, який витримують добу в термостаті при 37 ºС і 24 години при температурі (20-25 º) С.

Здатність зброджувати вуглеводи. Чисту культуру пересівають на середовища Гиса. Посіви інкубують 7 діб при (37±1) ºС, наявність ферментативної активності у відношенні вуглеводів визначають по зміні кольору середовищ за рахунок утворення кислоти.

Більшість бактерій роду Listeria не утилізують маніт (за винятком L. grayi та L. grayi subsp. murrayi).

Визначення нітрат-редукції проводять за ГОСТ 10444.8-88. Бактерії роду Listeria не відновлюють нітрати до нітритів (за винятком L. grayi і L. grayi subsp. murrayi).

Виявлення в посівах грампозитивних коротких тонких паличок, каталазопозитивних, що не відновлюють нітрати до нітритів, не утилізують маніт, рухливі при (25±1) ºС і нерухомі при (37±1) ºС, указує на належність виділених культур з до роду Listeria.

Для підтвердження приналежності виділених лістерій до виду L. monocytogenes визначають здатність до ферментації рамнози, ксилози, наявність лецитиназної і β-гемолитичної активності і проводять постановку CAMP-теста. Диференційні ознаки видів, роду Listeria зазначені в табл. 28.

Для видової диференціації виділених культур лістерій рекомендується використовувати біохімічні тест-системи API Listeria фірми “BioMerieux”. При їх застосуванні варто керуватися рекомендаціями виробника.

САМП-тест ставлять для диференціації L. monocytogenes від інших видів лістерій, що володіють β-гемолітичною активністю. Для проведення тесту 2-3-добові культури гемолітичних штамів S. aureus і R. equi засівають на кров'яний агар з еритроцитами барана двома рівнобіжними штрихами на відстані 5,0 – 5,5 см, як показано на мал. 1.

М іж вертикальними штрихами S. aureus і R. equi засівають рівнобіжними штрихами досліджувані культури лістерій на відстані друг від друга не менш 1 см і від вертикальних штрихів – 0,5 см. У якості контролю використовують тест-штами L. monocytogenes і L. ivanovii. Інкубують 24 години при (37±1) ºС. Визначають форму і розміри зон гемолізу біля вертикальних штрихів росту стафілокока і родокока.

Listeria monocytogenes дає розширення зони гемолізу біля штриха S. aureus (позитивний САМП-тест) і має відсутність змін зони гемолізу поруч зі штрихом R. equi (негативний САМП-тест).

Визначення лецитиназної активності. Дно двох чашок Петрі із середовищем № 1 (поживне середовище для культивування та підрахунку аеробних бактерій), що містять: 1 чашка – жовток курячого яйця і активоване вугілля, 2 чашка – жовток курячого яйця без активованого вугілля – ділять на кілька секторів або квадратів. Досліджувані культури і контрольні штами лістерій пересівають паралельно короткими штрихами на відповідні сектори чашок, з вугіллям і без нього. Інкубують 48 год. при (37±1) ºС. Чашки переглядають у минаючому світлі і визначають наявність активності в присутності і у відсутності активованого вугілля, порівнюючи з контрольними висівами музейних штамів. Listeria ivanovii дає щільну зону помутніння шириною 3-6 мм незалежно від присутності активованого вугілля. Listeria monocytogenes дає аналогічну зону помутніння в присутності активованого вугілля і не дає при відсутності вугілля. Інші види лістерій не дають зони помутніння.

Імунофлюоресценція – при фарбуванні лістерійними люмінесціюючими антитілами відбувається специфічне світіння типових клітин на 3-4+.

Біологічна проба – ставиться на білих мишах, підшкірним або внутрішньом'язовим зараженням в дозі 0,3-1 см³ добової зависі культури (10⁵-10⁶ м.к.). Лістерії викликають загибель тварин на 3-6 добу. При розтині виявлять численні некротичні вогнища у печінці, селезінці, нирках та міокарді.

Керато-кон'юнктивальна проба- проводиться шляхом нанесення на слизову оболонку ока морської свинки 2-3 крапель добової бульйонної культури лістерій. Через 18-24 години з'являється набряк віка, гіперемія, сльозотеча і через 36-72 години з ока виділяється гнійний ексудат.

Четвертий – шостий день Облік результатів посівів за кожним тестом ідентифікації культури окремо (таблиця 28).

Таблиця 28

Характеристика бактерій роду Listeria

Ознака

L.mono-cytogenes

L.ivano-vii

L.see-ligeri

L.inno-cua

L.grayi

L.wel-shimeri

Ферментація:

маніту

-

-

-

+

-

ксилози

-

+

+

-

-

+

рамнози

+

-

-

+/-

+/-

+/-

β-гемоліз

+

+

+

-

-

-

CAMP-тест збільшення гемолізу біля штриха:

R. equi

-

+

-

-

-

-

Staphylococcus aureus

+

-

+

-

-

-

Лецитиназна активність:

на середовищі з активованим вугіллям

+

+

-

-

-

-

на середовищі без вугілля

--

+

-

-

-

-

При негативних результатах перших висівів з середовищ збагачення, дослідження повторюються з наступних висівів, які повторюються через 7 – 10 діб протягом 3 тижнів.

15. СПОРОНОСНІ АЕРОБИ – B. cereus

15.1. Загальні положення

B.сereus ґрунтовий мікроорганізм надзвичайно широко розповсюджений у довкіллі – воді, повітрі і пилу приміщень, на устаткуванні й апаратурі підприємств харчової промисловості і громадського харчування. Завдяки широкому поширенню в довкіллі B.сereus часто виявляється в продуктах харчування, де при сприятливих умовах розмножується до кількостей 10⁶-10⁷ у 1 г і може викликати харчові отруєння.

Низька вимогливість до умов, необхідних для росту, приводить до того, що B.сеrеus може розмножуватися на будь-якому продукті харчування і внаслідок цього практично будь-який продукт при його масивному обсіменінні даним мікроорганізмом може привести до виникнення захворювання. У зв'язку з B.сеrеus описані отруєння, викликані м'ясними, рибними, рослинними і молочними продуктами, кондитерськими виробами.

За сучасною класифікацією B.сеrеus віднесений до роду Bacillus, групи 18 “Грампозитивні палички і коки, що утворюють ендоспори”, яка поєднує 25 видів.

У мазках з поверхні скошеного агару, пофарбованих за Грамом, B.cereus має вид великих, грампозитивних паличок зі злегка закругленими кінцями, що лежать у вигляді ланцюжків чи штахетоподібних скупчень, рідше – окремо один від одного. У висячій краплі рухливі, однак, можуть зустрічатися штами зі слабко вираженою рухливістю (близько 15%) і навіть зовсім позбавлені рухливості (менш 0,5%). На поверхні МПА утворюють великі розпластані колонії білого кольору зі злегка порізаними краями. На середовищах з жовтком колонії оточені широкою зоною глибокого рівномірного білого-матового коагуляту (позитивна реакція на лецитиназу). На поліміксинових середовищах із ТТХ (2,3,5 трифенилтетразолій хлорид) колонії B.cereus зернисті, матові, яскраво рубінового кольору на тлі зони білого коагуляту. На кров'яному агарі колонії B.cereus сіруватого забарвлення, зернисті у відбитому світлі, з перламутровим відливом у минаючому світлі, оточені зоною гемолізу різної інтенсивності. На стовпчику скошеного агару B.cereus дає суцільний білий ріст, іноді борошнистого виду. Ріст цього мікроорганізму на рідких поживних середовищах супроводжується помутнінням бульйону, утворенням пластівчастого осаду білого кольору (25-30% штамів) і ніжної білої плівки на поверхні середовища. Усі штами B.сеrеus згортають молоко, частково пептонізуючи його на 6-10 добу. Близько 85% штамів розріджують желатин протягом 1 – 4 діб. Усі без винятку штами B.cereus дають позитивну реакцію на лецитиназу й ацетилметилкарбінол, розщеплюють до кислоти глюкозу і мальтозу, а частина штамів – також сахарозу, гліцерин, декстрин, лактозу, галактозу, інулін і дульцит.