17. Диски з мальтозою та фруктозою
До 2 куб. см пептонної води, рН 7,2 додають вуглеводу і 0,5 куб. см 1% водного розчину фенолового червоного. Суміш нагрівають на водяній бані до повного розчинення вуглеводу. Розчином просочують диски або квадрати фільтрувального паперу (10 x ). Підсушують. Зберігають при температурі (6 +- 2) град. С 1 рік.
18. Тампони для забору носоглоткового слизу
Для забору носоглоткового слизу використовують ватні тампони, на металевому, краще алюмінієвому дроті діаметром 2-. Дротики згинають під кутом 135 град. на відстані 3- від кінця, на який накручений ватний тампон. Тампони вставляють у пробірки і стерилізують в автоклаві.
Додаток 3
ЗАСТОСУВАННЯ РЕАКЦІЇ
непрямої гемаглютинації для виявлення протименінгококових антитіл
1. Показання до проведення серологічних досліджень
Реакцію непрямої гемаглютинації (РНГА) з менінгококовими еритроцитарними діагностикумами серогруп А, В, С використовують у таких випадках:
а) як додатковий метод діагностики менінгококової інфекції. Обов'язковою вимогою є дослідження сироваток крові хворих, які взято у різні терміни від початку захворювання, тобто у динаміці. Оптимальним варіантом є обстеження усіх осіб (скринінг) з підозрою на генералізовані форми менінгококової інфекції (ГФМІ), що дозволить істотно збільшити відсоток лабораторного підтвердження ГФМІ (у дорослих - до 80%, у дітей до 60% випадків);
б) для ретроспективного виявлення локалізованих форм менінгококової інфекції в осередках захворювання;
в) при здійсненні імуно-епідеміологічних досліджень серед населення з метою визначення серонегативних контингентів;
г) при оцінці імунологічної ефективності протименінгококової вакцинації.
2. Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) з еритроцитарними менінгококовими діагностикумами
РНГА ставлять як макро- так і мікро-методом; в останньому випадку використовують мікротитратори "Такачі" або багатоканальні дозатори. Відмінності між цими методами полягають лише в об'ємах використовуваних інгредієнтів та термінах обліку результатів реакції. При макрометоді реагуюча суміш у кожній лунці складається із 0,5 куб. см відповідного розведення сироватки крові та 0,25 куб. см діагностикуму. При мікрометоді об'єми зменшуються: 0,05 куб. см та 0,025 куб. см відповідно.
Облік результатів дослідження у мікрометоді здійснюють через 2 години інкубації у термостаті, при макрометоді інколи необхідна додаткова експозиція протягом 1-2 години при кімнатній температурі.
Постановка здійснюється згідно інструкції до застосування діагностикумів.
3. Забір крові
Для серологічних досліджень кров від хворого на МІ або підозрілого на цю інфекцію забирають із ліктьової вени з додержанням звичайних правил асептики, при масових серологічних дослідженнях кров беруть із пальця.
Після утворення згустку одержану сироватку відсмоктують стерильною піпеткою у стерильний посуд (пробірки, ампули). Зберігають у холодильнику при (6 +- 2) град. С. У реакції досліджують сироватки без ознак проростання.
Перед постановою РНГА сироватки розводять у співвідношенні 1:5 вихідним буфером (ЗФР). Титрування сироваток крові здійснюють у стабілізуючому буфері.
Робота з сироваткою проводиться з дотриманням вимог біологічної безпеки.
4. Рекомендовані терміни, кратність обстеження та трактування результатів серологічних досліджень
При виборі оптимальних термінів та кратності обстеження хворих на ГФМІ і для правильного трактування результатів серологічних досліджень потрібно взяти до уваги ряд факторів, що впливають на рівень антитіл: вік хворого, преморбідний фон, клінічна форма, тяжкість і період хвороби, супутні захворювання, серологічні особливості збудника. При менінгококовій інфекції, як і при інших інфекційних захворюваннях, правильна оцінка серологічних досліджень можлива тільки при їх співставленні з епідеміологічними та клінічними даними.
Оптимальні терміни взяття крові у хворих - перші дні хвороби (1-3 дні), другий, третій та наступні тижні хвороби. Першу сироватку крові потрібно брати відразу при госпіталізації хворого, наступні - через 7-10 днів.
4.1. РНГА при генералізованих формах менінгококової інфекції
4.1.1. РНГА з діагностикумами А і С
Антитіла із групоспецифічними полісахаридами менінгококів серогруп А та С при ГФМІ можна виявити вже в перші дні хвороби. Кількість серопозитивних осіб серед дорослих хворих складає в указані строки біля 40%. Максимальний рівень антитіл відзначається на другому-третьому тижні хвороби, з четвертого-п'ятого тижня рівень антитіл поступово знижується.
За умовно-діагностичний титр антитіл до полісахаридів менінгококу серогруп А і С у дорослих і дітей старших за 3 роки приймають позитивну реакцію в розведеннях 1:40-1:80, у неінфікованих в момент обстеження антитіла у таких титрах зустрічаються порівняно рідко (9-11%).
У дітей віком до 1 року вироблення антитіл виражено слабо, у зв'язку з чим позитивні реакції спостерігаються звичайно у більш пізні терміни (з другого тижня хвороби).
У дітей, молодших за 3 роки, за умовно-діагностичний титр антитіл до полісахаридів А і С приймають позитивну реакцію у розведенні 1:20 та вище, оскільки в здорових дітей цього віку антитіла не виявляються або зустрічаються у поодиноких випадках у титрах не вище, ніж 1:5-1:10.
Інтенсивність антитілоутворення не однакова при різних клінічних формах менінгококової інфекції. При менінгококцемії і змішаних формах (менінгококцемія + менінгіт) рівень антитіл звичайно вищий, ніж при інших формах хвороби.
При важкому перебігу ГФМІ, особливо при інфекційно-токсичному шокові, протименінгококові антитіла виявляються в низьких титрах, в окремих випадках не виявляються зовсім. При дуже важкому перебігу хвороби, особливо при наявності важких ускладнень, антитілоутворення виражено слабо: у гострому періоді хвороби виявляються близько 10% серопозитивних проб з низькими титрами (1:5-1:10). Надалі, при поліпшенні стану хворих, титри антитіл та кількість серопозитивних проб може зростати.
Виявлення на першому тижні хвороби антитіл до полісахаридів менінгококів серогруп А і С у титрі 1:160 та вище підтверджує менінгококову етіологію захворювання. У деяких випадках такі титри антитіл можуть зберігатися і в пізніші терміни захворювання. У таких хворих, навіть коли не спостерігається сероконверсія, високі показники РНГА можуть служити достатньою підставою для підтвердження діагнозу ГФМІ.
Діагноз ГФМІ визначається як етіологічно підтверджений при наявності динаміки (4-кратного і більше) збільшення рівня антитіл. При двократному збільшенні титру антитіл діагноз оцінюється як підтверджений лише при вираженій клінічній картині захворювання.
Кількість етіологічно підтверджених випадків ГФМІ методом РНГА може досягати: у дорослих - 80%, у дітей - в середньому 70% (у віковій групі дітей 3 років - 60%, у старших вікових групах - 80%).
4.1.2. РНГА з діагностикумом серогрупи В
Інтерпретуючи дані серологічних досліджень, які одержано при роботі з діагностикумом на основі полісахариду менінгокока серогрупи В, потрібно враховувати такі моменти.
Полісахарид менінгокока серогрупи В - слабкий імуноген, його хімічна структура є ідентичною до полісахариду E. coli K1. Носійство менінгококів цієї серогрупи може досягати 50% і більше від числа серогрупованих штамів, виділених від здорових осіб, що може відбитись на високому фоновому рівні антитіл до полісахариду В серед населення (в 50% випадків можуть визначатися антитіла в титрах 1:80 та вище).
Генералізовані форми менінгококової інфекції, що обумовлені менінгококом серогрупи В, найчастіше (до 60%) виникають у дітей перших 3 років життя, у яких антитілоутворення виражено слабо. При ГФМІ у дорослих в більшості випадків, в перші дні хвороби рівень антитіл до менінгококу серогрупи В складає 1:20-1:40, з подальшою сероконверсією на 2-3-му тижнях. В окремих випадках (14%) наявність антитіл на 2-3-му тижнях може досягти титрів 1:640-1:1280 і вище.
Враховуючи широку циркуляцію менінгококів серогрупи В серед населення, визначити умовно-діагностичний титр антитіл до менінгококу цієї групи дуже складно. Серологічним підтвердженням клінічного діагнозу ГФМІ, викликаної менінгококами серогрупи В, можна визнавати збільшення рівня антитіл у дорослих від 1:160, у дітей - з 1:40 і вище.
4.1.3. Групова специфічність РНГА
При постановці РНГА з набором еритроцитарних діагностикумів може виявлятись одночасно присутність антитіл до декількох полісахаридів. У таких випадках серогрупи менінгококів визначають за динамікою збільшення рівня антитіл до одного із полісахаридів. При цьому різниця показників парних сироваток має бути не менш, ніж на 2 розведення. При отриманні однакових титрів антитіл до 2 полісахаридів в умовно-діагностичних титрах діагностуються ГФМІ без установлення серогрупи збудника.
4.2. РНГА при локалізованих формах менінгококової інфекції (назофарингіт і бактеріоносійство)
При локалізованих формах менінгококової інфекції серологічні дослідження не слід розглядати як метод діагностики, оскільки питання про носійство або наявність менінгококового назофарингіту вирішується на підставі бактеріологічного обстеження. Але у деяких випадках при проведенні досліджень в осередках ГФМІ серологічні дані можуть стати додатковим тестом, ретроспективно підтверджуючи клініко-епідеміологічний діагноз менінгококової інфекції. При цьому слід проводити обов'язкове дослідження парних зразків сироваток крові, отриманих з 10-14-добовим інтервалом.
При назофарингітах антитілоутворення вираженіше, ніж при бактеріоносійстві. У хворих на назофарингіт менінгококової етіології у 90% випадків виявляються протименінгококові антитіла, з них у 50% випадків - титри 1:40 і вище. Серед бактеріоносіїв, незалежно від серогрупи збудника, специфічні антитіла виявляються у 65% випадків, а з титрами 1:40 і вище - у 30% носіїв.
У сироватках крові, отриманих від носіїв, так як і від хворих, можуть виявлятися антитіла до декількох полісахаридів менінгококу. Збільшення антитіл до гомологічної серогрупи відзначають при носійстві менінгококу серогрупи А. В окремих випадках динаміка антитіл (сероконверсія) не дозволяє установити домінуючу серогрупу менінгококу. Тоді визнають носійство без установлення серогрупи.
4.3. РНГА при імуно-епідеміологічних дослідженнях
Метою імуно-епідеміологічних досліджень є визначення кількості осіб, сприйнятливих до менінгококової інфекції, та груп ризику. Аналіз здійснюють за кількістю серопозитивних та серонегативних осіб з урахуванням існуючої епідемічної ситуації. У період епідемічного неблагополуччя збільшується число серопозитивних осіб та відповідно зменшується число серонегативних до епідемічної серогрупи менінгококу. В період спорадичної захворюваності, навпаки, зростає кількість серонегативних осіб.
При проведенні імуно-епідеміологічних досліджень серед населення об'єм репрезентативних вибірок установлюється епідеміологом відповідно до кількості та вікового складу колективу, району, населеного пункту.
Визначений фоновий рівень протименінгококових антитіл пов'язаний з захворюваністю на менінгококову інфекцію на даній території і рівнем носійства. Найбільш високий рівень антитіл у різні епідеміологічні періоди визначають до менінгококів серогрупи В, що, можливо, відображає їх серологічну спорідненість з E. coli K1, моракселами, непатогенними нейсеріями. При цьому число серопозитивних проб з титрами антитіл 1:20 і вище може досягати 90%.
До менінгококів серогрупи С рівень антитіл менший, кількість серопозитивних сироваток крові з титром антитіл 1:20 і вище складає 8%.
Рівень антитіл до менінгококів серогрупи А дає досить чітку характеристику епідемічної ситуації і відображає широту циркуляції збудника.
Аналіз серологічних результатів епідеміологічних досліджень здійснюють на підставі розрахунку наступних показників:
а) відсотку серонегативних проб, отриманих з кожним із діагностикумів (A, B, C), який може відображати число сприйнятливих до менінгококової інфекції осіб;
б) відсотку серопозитивних проб (усі серопозитивні сироватки крові, розпочинаючи з розведення вище 1:5), із числа яких виділяють проби з титрами антитіл:
- у віковій групі до 3 років з 1:10 і вище до полісахаридів А і С, з 1:20 і вище - до полісахарида В;
- у старших вікових групах дітей і дорослих з 1:20 і вище до полісахаридів А і С, з 1:80 і вище - до полісахариду В. Відсоток сироваток крові з указаними вище рівнями антитіл відображає домінуючі на конкретній території серогрупи менінгококу.
4.4. Застосування РНГА для оцінки ефективності вакцинопрофілактики менінгококової інфекції
Формування поствакцинального імунітету носить групоспецифічний характер. У зв'язку з цим, в залежності від використаної для профілактики менінгококової вакцини, серологічне дослідження для оцінки ефективності вакцинації проводять, застосовуючи РНГА з гомологічним діагностикумом.
При вакцинації дорослих специфічні менінгококові антитіла до полісахариду А виявляють у високих титрах (1:40 - 1:640 і вище) не менше, ніж у 80% щеплених уже на 3-4-му тижні після вакцинації. Протягом наступних 6-8 місяців у щеплених титри антитіл у певній мірі знижуються, але зберігаються на підвищеному рівні більше 2 років.
