Страница 3: Методичні вказівки з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів (45092)

H. influenzae в мазках - дрібні грамнегативні кокобактерії або палички, схильні до поліморфізму, оточені ледь помітною ніжною капсулою, розташовані у вигляді коротких ланцюжків або ниток.

Пневмококи мають вигляд ланцетовидних диплококів та коротких ланцюжків, утворюють капсулу; вони грампозитивні, добре фарбуються усіма аніліновими барвниками, при цьому капсула залишається безбарвною і помітна тільки на забарвленому фоні.

Опис морфології інших бактерій викладений у відповідних нормативних документах та довідниках.

Виявлення в мазках типових менінгококів або інших мікроорганізмів є підставою для видачі попередньої відповіді, про що негайно інформують лікаря лікувально-профілактичної установи.

    Виділення збудника.  Стерильною  пастерівською піпеткою з дна

пробірки беруть  0,3-0,5  куб.  см  матеріалу  і  по  2-3   краплі

засівають:   на  сироватковий,  5%  кров'яний,  "шоколадний"  (або

середовище  Левінталя)  агари  і  на   середовище   для   контролю

стерильності.  При  необхідності,  в  залежності  від  результатів

мікроскопії осаду, можна додатково зробити посів на середовища ЖСА

і  Ендо.  Така різноманітність середовищ,  що використовується для

первинного    посіву    СМР    дозволяє    прискорити    виділення

мікроорганізмів,   які   можуть   бути   чинниками   бактеріальних

менінгітів. Посіви   поміщають   в   термостат   при   температурі

(37 +- 1) град. С і створюють умови з підвищеною концентрацією СО

                                                                2

(5-10%).

При наявності достатньої кількості СМР рекомендується 2-3 краплі засіяти на чашку з АГВ або середовищем Мюллер-Хінтона і визначити чутливість мікроорганізма до антибіотиків.

Решту СМР використовують для проведення серологічних досліджень (коаглютинація, латекс-аглютинація, імуноферментний аналіз, ЗІЕФ), полімеразної ланцюгової реакції, тощо та для посіву у середовище збагачення (4 куб. см 0,1% напіврідкого агару з 1 куб. см сироватки). Посіви СМР витримують у термостаті до 7 діб при температурі (37 +- 1) град. С з періодичними висівами на тверді поживні середовища.

Через 24 години візуально та за допомогою стереоскопічного мікроскопа переглядають усі чашки з посівами незалежно від результатів попередньої бактеріоскопії ліквору. Чашки без росту інкубують ще добу. До уваги беруть усі різновиди колоній.

Менінгокок на сироватковому агарі утворює плоскі, круглі з рівним краєм, ніжні колонії з опалесценцією розміром 2-. На "шоколадному" та кров'яному агарах його колонії ніжні, сіруватого кольору, з блискучою поверхнею та рівними краями, мають маслянисту консистенцію, розмірами до . Менінгококи не змінюють кольору середовища.

Гемофіли на "шоколадному" агарі дають досить пишне розростання, їм притаманний різкий специфічний запах індолу. Колонії сірого кольору, плоскі, діаметром 0,2-, легко знімаються з середовища. На кров'яному агарі через добу з'являються дрібні прозорі колонії, схожі на краплинки роси або взагалі ріст може бути відсутнім. На МПА та сироватковому агарі H. influenzae не росте.

Колонії пневмококів на кров'яному, як і на "шоколадному" агарі, дрібні (діаметром 0,1-), сіруваті, плоскі, іноді з вдавленим центром, оточені зоною альфа-гемолізу. За зовнішнім виглядом колонії пневмококів важко відрізнити від колоній стрептококів групи В, інших "зеленячих" стрептококів - SS. mitis, oralis, sanguis, parasanguis, gordonii та ентерококів (E. faecalis), які в деяких випадках можуть викликати менінгіт, особливо у дітей до 1 року. На сироватковому агарі пневмококи утворюють дрібні, ніжні ледь жовтуваті колонії. Пневмококи при рості на кров'яному агарі можуть давати декілька типів колоній, що залежить від того, на скільки виражена капсула. Колонії пневмокока з розвинутою капсулою можуть мати декілька міліметрів в діаметрі і бути настільки слизистими, що нагадують краплину олії на поверхні агару. Їх розпізнавання не викликає труднощів. Штами, у яких не виражена капсула, дають колонії невеликих розмірів і їх виділення пов'язане з певними труднощами. При перегляді цих колоній у стереоскопічний мікроскоп можна розгледіти характерні морфологічні особливості росту цього мікроорганізма: сіруватий відтінок колоній, випукла поверхня і волога "сметаноподібна" консистенція. При тривалому інкубуванні (48 годин і більше) центральна частина колонії може опуститись, надаючи їй характерну блюдцеподібну форму (це, певною мірою, пояснюється дією аутолізинів пневмокока). Деякі штами можуть давати абсолютно сплющені колонії.

Останнім часом спостерігаються поодинокі випадки та спалахи гнійних менінгітів, які викликані піогенним стрептококом (S. pyogenes). Колонії цього збудника легко відрізнити від інших стрептококів по зоні бета-гемолізу на кров'яному агарі.

Великі (3-) колонії, які містять в собі грамнегативні палички, слід запідозрити у належності до ентеробактерій та псевдомонад.

Гриби роду Candida ростуть на всіх середовищах, не змінюючи кольору агару з кров'ю.

Мікроорганізми роду Acinetobacter добре ростуть на кров'яному і сироватковому агарах, а також на поживних середовищах без додавання нативного білка. Утворюють великі, білі, круглі й блискучі, часто слизисті колонії, на середовищах з кров'ю можуть давати зону гемолізу.

Для визначення чистоти культури та подальшого шляху ідентифікації готують мазки, фарбують за Грамом, ставлять реакцію з 3% розчином КОН та перші найпростіші біохімічні тести на оксидазу, каталазу (при підтвердженні чистоти культури), а також відсівають колонії на елективні середовища для накопичення чистої культури для подальшої ідентифікації.

Ідентифікація збудника менінгіту. Враховуючи характер росту, морфологію клітин і результати вказаних біохімічних тестів, вирішують ймовірну належність вирощеного мікроорганізму до того чи іншого роду й обирають шлях подальшого його вивчення й ідентифікації.

В таблиці 2 підсумовано мінімальну кількість ознак, достатніх для того, щоб виділені бактерії попередньо зарахувати до того або іншого таксону й обрати подальший шлях ідентифікації. На цьому етапі можлива видача попередньої відповіді.

Колонії, підозрілі на менінгокок, відсівають на СА для отримання та накопичення чистої культури, яку в подальшому ідентифікують за характерними властивостями та вивчають її чутливість до антибіотиків. Для диференціації N. meningitidis і B. (M) catarrhalis культуру відсівають у дві пробірки з СА та одну - з поживним агаром (МПА). Посіви на СА вирощують паралельно при температурі (37 +- 1) град. С та (22 +- 1) град. С, на МПА - при (37 +- 1) град. С. Одночасне культивування виділеного збудника на МПА і СА є простим і надійним тестом, що дозволяє диференціювати Neisseria meningitidis, не здатну рости на СА при (22 +- 1) град. С та на МПА при (37 +- 1) град. С, від схожої на неї B. (M) catarrhalis. Вивчають біохімічні властивості нейсерій: відсутність росту на агарі з 0,2% вмістом жовчі або затримка росту навколо дисків з жовчу; активність у відношенні до вуглеводів (глюкози, мальтози, сахарози, фруктози, лактози); редукція нітратів; здатність утворювати полісахарид на середовищі з 5% вмістом сахарози (додаток 1).

Таблиця 2

Властивості основних збудників ГБМ,

які враховуються через 24 години від початку

бактеріологічного дослідження ліквору або крові

Примітки:

* В краплю 3% розчину КОН вносять петлю (колонію) культури, емульгують. Утворення в краплі драглюватої маси, яка тягнеться за петлею, вказує на наявність грамнегативної флори (+), крихку консистенцію утворює грампозитивна (-) флора.

** Для ідентифікації H. influenzae необхідне визначення залежності їх росту від присутності в середовищах факторів X і V.

Чиста культура, що підозрюється в належності до виду N. meningitidis, підлягає серогрупуванню за допомогою реакції аглютинації з менінгококовими сироватками.

Колонії, підозрілі на пневмокок та інші стрептококи, відсівають на КА для вивчення характеру гемолізу та чутливості до жовчі та оптохіну (Табл. 3). Крім того, за допомогою полівалентної пневмококової сироватки можна виявити пневмококові капсульні полісахаридні антигени. Для прискореного виявлення пневмокока безпосередньо із чашки первинного посіву використовують реакцію латекс-аглютинації.

Таблиця 3

Диференціальні властивості стрептококів

та ентерококів, які викликають менінгіт

Примітки:

* До групи "зеленячих" належать S. sanguis, S. mitior, S. milleri, S. mutans та ін.

** Тест заснований на посиленні лізису еритроцитів і збільшенні утворюваних зон гемолізу при вирощуванні на кров'яному агарі S. agalactiae разом із стафілококом, продуцентом токсину.

*** Допускається постановка одного з тестів: з жовчу або з оптохіном.

Колонії, підозрілі на H. influenzae, відсівають для вивчення потреби в X та V факторах, характерної ознаки для цього виду мікроорганізму. Для цього відібрані і вирощені на ША колонії суспендують у поживному бульйоні або пептонній воді (Дотримуйтесь максимальної обережності, не допускаючи попадання шматочків середовища до суспензії, оскільки навіть маленька часточка агару може схибити результат!). Суспензію висівають петлею великого діаметра на чашку з МПА, потім на посів викладають смужки або диски з X, V та XV факторами. H. influenzae виростає тільки навкруг дисків з XV факторами.

Таблиця 4

Основні диференційно-діагностичні властивості

роду Haemophilus