---------------
* для первинної ізоляції потребує геміну.
Крім того, вивчити потребу в X та V факторах можна іншим шляхом.
1) Визначення здатності до сателітного росту (метод так званих "годівниць"). Для цього на чашку з КА засівають досліджувану культуру, а на поверхню зробленого посіву висівають 3-4 "бляшки" S. aureus. Якщо спостерігається ріст на КА навколо колонії гемолітичного S. aureus, досліджуваний мікроб належить до Haemophilus spp.
2) Тест з сапоніном. Досліджувану культуру інокулюють в
ізотонічному розчині натрію хлориду, засівають на поверхню 5% КА.
На посів кладуть диски з сапоніном та інкубують чашки 24-48 годин
при температурі 37 +- 1 град. С і 5-10% СО в атмосфері
2
вирощування. Наявність росту навколо диску з сапоніном і
відсутність такого поза зоною гемолізу вказує на належність
досліджуваного мікроорганізма до родини Haemophilus.
Для ідентифікації H. influenzae, крім потреби в X- та V-факторах, наявності каталази, оксидази, вивчають наявність бета-галактозидази, уреази, нітратредуктази та здатність до індолоутворення.
На основі тестів на продукцію індолу, уреазну і орнітиндекарбоксилазну активність розрізняють 8 біотипів (див. таблицю 5).
Таблиця 5
Біотипування H. influenzae
|
Біотип |
Індол |
Уреаза |
Орнітиндекарбок-силаза |
|
H. influenzae I |
+ |
+ |
+ |
|
H. influenzae II |
+ |
+ |
- |
|
H. influenzaeIII |
- |
+ |
- |
|
H. influenzae IV |
- |
+ |
+ |
|
H. influenzae V |
+ |
- |
+ |
|
H. influenzae VI |
- |
- |
+ |
|
H. influenzaeVII |
+ |
- |
- |
|
H. influenzaeVIII |
- |
- |
- |
При підозрі на ентеробактерії, синьогнійну паличку, піогенний стрептокок, стафілокок та ацинетобактер проводять дослідження згідно з відповідними нормативними документами.
При підозрі на лістерії, якщо дозволяє кількість колоній, проводять низку досліджень, а також тест на чутливість до антибіотиків. Для L. monocytogenes, крім ознак, вказаних в табл. 2, є характерним: рухливість при кімнатній температурі, здатність розкладати мальтозу, глюкозу, не активність у відношенні до дульциту, маніту, сорбіту та арабінози. Сахарозу та гліцерин розкладає повільно. L. monocytogenes утворює крайову зону гемолізу на агарі з 5%-ним вмістом баранячої крові.
Для ідентифікації Candida albicans роблять посів з підозрілих білих випуклих колоній на середовище Сабуро та картопляну воду для визначення філаментації.
Якщо прямий посів на чашки з поживним середовищем не дав росту колоній, то слід зробити висів на чашки з КА та ША із збагачувального середовища, що інкубувалося в термостаті.
При менінгіті в СМР виявляється, як правило, один вид мікроорганізмів, мікст-інфекція мозкових оболонок зустрічається вкрай рідко. Тому, з метою прискорення видачі результату, на другий день одночасно можна робити висіви з однотипних колоній на середовище для отримання чистої культури та на диференційно-діагностичні середовища, вивчення культури за низкою ознак та на чутливість до антибіотиків.
Кров. Засіяні флакони з кров'ю поміщають в термостат при температурі (37 +- 1) град. С на 24 години.
При наявності росту у поживних середовищах первинного посіву - мікроскопують. В залежності від результатів бактеріоскопії висівають із флаконів на СА, КА чи ША. Чашки інкубують при температурі (37 +- 1) град. С в ексикаторах зі свічкою. Облік результатів посіву на СА, КА чи ША проводять так, як описано у розділі щодо дослідження ліквору.
Переглядають чашки з посівами. При відсутності росту висівають щодня або через день із флаконів з відібраним матеріалом, що інкубується, протягом тижня. При наявності підозрілих колоній відсівають їх для отримання чистої культури. Подальшу ідентифікацію гемокультури проводять як і при дослідженні СМР. Вивчають чутливість виділених мікроорганізмів до антибіотиків.
Слиз носоглотки. Доставлені засіяні чашки та тампони, занурені в напіврідке середовище, поміщають в термостат при температурі (37 +- 1) град. С.
Змочені тампони або тампони в транспортному середовищі
(попередньо відтиснувши об стінки пробірки) засівають на чашку з
СА, ША та КА. Засіяні чашки переносять на 24 години у термостат з
температурою (37 +- 1) град. С, створивши для них умови
підвищеного вмісту СО . На другий день переглядають чашки, засіяні
2
напередодні, візуально та під стереоскопічним мікроскопом. При
наявності росту мікроскопують підозрілі колонії і відсівають для
отримання чистої культури і в подальшому ідентифікують її. При
відсутності росту на чашках проводять повторний перегляд їх через
40-48 годин від посіву, і роблять висів з напіврідкого середовища
збагачення.
Подальшу ідентифікацію проводять як і при дослідженні СМР. Вивчають чутливість виділених мікроорганізмів до антибіотиків.
Ексудат із петехій. Відібраний матеріал засівають на чашки Петрі з СА, що містить антибіотики (ристоміцин або лінкоміцин) для пригнічення росту мікрофлори шкіри. Із залишку ексудату готують мазки для мікроскопії. Крім того, мазки із вмісту петехій можна приготувати у вигляді відбитків. Для цього стерильною петлею обережно скарифікують поверхню петехій, потім прикладають кількома місцями стерильне предметне скло; відбитки фіксують полум'ям пальника, фарбують. На підставі даних мікроскопії можлива видача попередньої відповіді.
Засіяні чашки інкубують при температурі (37 +- 1) град. С 24 години (при відсутності росту - 48 годин), підозрілі на менінгокок колонії відсівають і вивчають за описаною схемою. Вивчають чутливість виділених мікроорганізмів до антибіотиків.
5. Методи бактеріологічного та біохімічного вивчення менінгококів, пневмококів та гемофілів
5.1. Створення підвищеної концентрації вуглекислого газу для культивування посівів
Рекомендується при первинному виділенні збудників менінгіту з ліквору, крові та одержанні біомаси.
З цією метою використовують СО -термостати, генератори GENbox
2
з газпакетами. При відсутності СО -термостатів та генераторів
2
GENbox з газпакетами для створення підвищеної концентрації СО
2
можна використовувати будь-який посуд з притертою кришкою,
наприклад, ексикатор. Засіяні чашки розміщують в середині посудини
догори дном, там же закріплюють запалену свічку висотою 2- та
накривають кришкою. До моменту затухання свічки створюється
підвищена концентрація СО (7-10%). Після цього посіви ставлять в
2
термостат.
5.2. Проба на каталазу
Метод базується на здатності мікроорганізмів, що мають фермент каталазу, розщепляти перекис водню, утворюючи воду та кисень. Не можна використовувати для постановки тесту культуру, вирощену на кров'яному агарі, оскільки каталаза еритроцитів може давати хибно-позитивні результати.
На предметне скло наносять краплю 10% перекису водню, в неї скляною паличкою або платиновою петлею вносять культуру і розтирають круговими рухами. При позитивній реакції утворюється піна (бульбашки газу).
5.3. Проба на оксидазу
Для постановки тесту слід використовувати комерційні диски або смужки для визначення оксидази (такі як СІП для визначення оксидази, смужки для виявлення цитохромоксидази виробництва PLIVA-Lachema). За відсутності комерційних препаратів застосовують індофенольний метод або метод Ковача.
Дослідження проводять з тест-реактивами:
1. Індофенольний метод
Розчин А - альфа-нафтол - ;
Спирт етиловий (96 град.) - до 100 куб. см.
Розчин Б - N, N-диметил-п-фенілендіамін - ;
Спирт етиловий (96 град.) - до 100 куб. см.
Інгредієнти розчинити, тест-реактиви зберігати в прохолодному темному місці розчин А - до 10 діб, розчин Б - не більше 1 дня.
Ці розчини можна безпосередньо наносити по краплі на колонію або просочити смужку фільтрувального паперу, на якому розтирають матеріал із мікробної колонії. Оксидазопозитивні культури через 0,5-1,0 хвилину дають темно-синє забарвлення.
2. Метод Ковача
Тетраметил-п-фенілендіаміну гідрохлорид - ;
Дистильована вода - до 100 куб. см.
Розчинити реактив у воді, зберігати в холодильнику при температурі (6 +- 2) град. С до 2 тижнів.
Смужку фільтрувального паперу просочують реактивом, на ній розтирають матеріал із колонії. Можна нанести краплю реактиву безпосередньо на ізольовану колонію. Оксидазопозитивні культури через 10-30 сек. дають рожеве з переходом у лілове забарвлення.
Добову агарову культуру наносять у вигляді штриха платиновою чи пластиковою петлею, або скляною чи дерев'яною паличкою або пастерівською піпеткою.
Щоразу при постановці тесту проводять контрольні дослідження з тест-культурами мікроорганізмів, які дають позитивну (Pseudomonas aeruginosa) і негативну (E. coli) реакції.
5.4. Визначення сахаролітичної активності
Для визначення сахаролітичної активності використовують комерційні ідентифікаційні набори такі як: МИКРО-ЛА-ТЕСТ (Нейсеріятест, Нефермтест, Стафітест, Стрептотест, Ентеротест та ін.) фірми Pliva-Lachema; API 20 NE, API 20 E, Rapid 20 E, API Listeria, API Staph, API NH, API 20 STREP, API Candida та ін. виробництва bioMerieux (офіційний представник фірми bioMerieux в Україні СП "Бівакс"). Дослідження виконують за інструкцією до препаратів.
Можна також застосовувати індикаторні паперові тест-системи. Для цього готують 1,5 куб. см густої суспензії досліджуваної культури в ізотонічному розчині натрію хлориду з рН 7,2, вносять її по 6 крапель в 5 пробірок. В кожну з пробірок поміщають індикаторний диск з вуглеводом (глюкозою, сахарозою, лактозою, мальтозою, фруктозою або левульозою) та індикатором феноловим червоним. Пробірки заливають вазеліновим маслом і витримують в термостаті при температурі (37 +- 1) град. С. Про розщеплення вуглеводів свідчить зміна кольору дисків з малиново-червоного на жовтий. Облік результатів можливий через 6-24 години. Диски з глюкозою, лактозою і сахарозою використовують з наборів СІП для ідентифікації ентеробактерій або холерних вібріонів.
При відсутності дисків або наборів використовують середовища з вуглеводами для визначення сахаролітичних властивостей.
5.5. Визначення продукції полісахаридів N. meningitidis на агарі з 5% вмістом сахарози
Густо висівають культуру петлею на сектор чашки Петрі з сироватковим агаром, що містить 5% сахарози. Через 48 годин інкубації в термостаті при температурі (37 +- 1) град. С на поверхню вирощеної культури наносять 1 краплю водного розчину Люголя. Реакція вважається позитивною при утворенні бурого забарвлення вирощених колоній.
5.6. Йодний тест для N. sicca
Реакцію на йод визначають на культурі, вирощеній бляшками на середовищі для постановки вказаного тесту (див. Додаток 2). На культуру пастерівською піпеткою наносять 1 краплю 0,25% водного розчину йоду. Позитивна реакція (поява синього забарвлення бактеріальної маси) характерна тільки для виду N.sicca.
5.7. Визначення редукції нітратів
Метод базується на здатності мікроорганізмів відновлювати солі азотної кислоти (нітрати) до солей азотистої кислоти (нітритів). Перед посівом менінгококів до нітратного бульйону додають 20% інактивованої сироватки. Посіви витримують в термостаті при (37 +- 1) град. С до 5-7 діб. Після інкубації в пробірку з культурою вносять 3 краплі реактиву Гріса (суміш розчинів № 1 і № 2) або Касаткіна.
Поява червоного забарвлення через 30 секунд після додавання реактивів Гріса або Касаткіна свідчить про редукцію нітратів до нітритів - реакція позитивна. Відсутність забарвлення свідчить про те, що реакція негативна або відбулося відновлення до послідуючих продуктів (аміаку, молекулярного азоту, оксиду азоту, гідроксиламіну). Тому при відсутності забарвлення в пробірку додають на кінчику скальпеля порошок металічного цинку і результат оцінюють знову:
- забарвлення не з'являється - нітрати в середовищі відсутні, оскільки відновлені бактеріями до нітритів і далі до послідуючих продуктів відновлення;
- з'являється червоне забарвлення - нітрати в середовищі редуковані до нітритів, але не бактеріями, а цинком (реакція негативна).
5.8. Застосування дисків з жовчу для ідентифікації збудників менінгітів
Колонії мікроорганізмів, морфологічно схожі з менінгококовими, відсівають на сектори чашок Петрі з 20% сироватковим агаром. На кожний сектор накладають стерильний диск, просочений концентрованою жовчу (диски готують заздалегідь). Культури менінгококів навколо дисків з жовчу дають зону затримки росту, що ніколи не спостерігається при рості непатогенних нейсерій.
Можна використовувати середовище з 0,2% жовчі для вивчення ставлення мікроорганізму до жовчі.
5.9. Оптохіновий тест
Для постановки цього тесту можна використовувати готові комерційні диски з оптохіном, які накладають на щойно посіяну на КА культуру. У пневмококів навколо диску з оптохіном утворюється зона затримки росту.
5.10. Визначення ферменту уреази
Метод базується на здатності мікроорганізмів, які мають фермент уреазу, розщеплювати сечовину до аміаку, за рахунок якого відбуваються зміни рН середовища, що визначають за зміною кольору індикатора.
Пробу на уреазу можна ставити за методом Заксе: змішують (ex tempore) реактив А (1 частину) і реактив В (19 частин). Суміш розливають у вузькі пробірки по 0,1 куб. см і вносять кілька петель досліджуваної культури. Не можна брати конденсаційну воду, оскільки вона має лужну реакцію і може змінити pH середовища, а отже і колір індикатора. Пробірки ставлять в термостат на 30 хвилин.
