Уреаза розщеплює сечовину, змінює pH середовища, що призводить до його почервоніння. Якщо фермент уреаза відсутній, зміна забарвлення середовища не відбувається. Рекомендується одночасно ставити контроль середовища. Облік негативної реакції можливий тільки після 24 годин інкубації.
5.11. Визначення індолоутворення
Метод базується на здатності мікроорганізмів розщеплювати амінокислоту триптофан з утворенням індолу.
З цією метою можна використовувати папірці із СІП. Пробірки з поживним бульйоном засівають однією петлею культури і додають 2-3 краплі інактивованої сироватки коня. Пробкою затискають індикаторний папірець на індол, просочений пара-диметиламіно-бензальдегідом. Інкубують при (37 +- 1) град. С 18-24 години. При наявності індолоутворення жовтий папірець набуває рожево-малинового кольору.
Для визначення індолоутворення у H. influenzae слід використовувати "шоколадний бульйон".
5.12. Визначення наявності орнітиндекарбоксилази
У пробірку з 0,3-0,5 куб. см фізіологічного розчину вносять диск з орнітином (можна використовувати СІП) і додають декілька крапель добової бульйонної культури H. influenzae, заливають стерильним вазеліновим маслом і інкубують протягом 18-24 годин при температурі (37 +- 1) град. С. При позитивному результаті з'являється синє забарвлення.
Для визначення наявності орнітиндекарбоксилази у H. influenzae слід використовувати культуру вирощену на "шоколадному бульйоні".
5.13. Визначення наявності бета-галактозидази у штамів H.influenzae
Бета-галактозидаза - фермент, що здатний безпосередньо гідролізувати лактозу до галактози та глюкози. ONPG (O-нітрофеніл-бета-D-галактопізнозидаза) - речовина, схожа за структурою з лактозою. У присутності бета-галактозидази ONPG руйнується на галактозу і O-нітрофенол, який надає жовтого забарвлення. H. influenzae на відміну від інших представників роду не має бета-галактозидази і це використовується як диференційно-діагностична властивість мікроорганізма.
Для постановки тесту слід використовувати комерційні диски просочені ONPG.
В 0,5 куб. см фізрозчину готують густу суспензію досліджуваної культури (еквівалент 2 одиницям за стандартом мутності МакФарланда) і вносять туди диск з ONPG, інкубують при температурі (37 +- 1) град. С. Попередній облік проводять через 1 годину. Позитивна реакція - наявність жовтого забарвлення. Негативний результат може бути врахований тільки після 24 годин інкубації.
6. Методи серологічної діагностики та типування збудників гнійних бактеріальних менінгітів
Для виявлення антигенів (Аг) збудника ГБМ у якості експрес-діагностики можуть використовуватись реакція латекс-аглютинації, зустрічний імуноелектрофорез, непрямий метод флуоресцуючих антитіл, реакція непрямої гемаглютинації з антитільними еритроцитарними діагностикумами, реакція коаглютинації.
6.1. Реакція латекс-аглютинації
Відомим "некультуральним" методом виявлення антигенів
збудників ГБМ є метод латекс-аглютинації (ЛА) із застосуванням
відповідних комерційних тест-систем. Латексні частки, покриті
специфічними антитілами до антигенів N. meningitidis,
S. pneumoniae або H. influenzae, аглютинують у присутності
бактеріальних антигенів, що містяться в СМР; результат аглютинації
оцінюється візуально. Постановка всієї реакції займає близько
10 хв., реакція не вимагає наявності живих бактерій у СМР. Досвід
роботи показує, що діагностика ГБМ методом ЛА з тест-системами
фірми BioMerieux (Франція), дозволяє довести лабораторне
підтвердження ГБМ до 60-70%. Однак чутливість методу ЛА порівняно
невисока (біля 70%), оскільки мінімальна обумовлена концентрація
бактерій у СМР методом ЛА складає від
5 6
10 до 5 х 10 бактерій/куб. см або від
1 до 50 нг антигену/куб. см. Методику постановки реакції див. в
інструкції по використанню тест-системи.
В практичній діяльності найчастіше застосовуються серологічні методи типування, основані на виявленні антигенних детермінант молекул, представлених на бактеріальній поверхні, - полісахаридів, білків, липополісахарида і т.і. Як вже було сказано, менінгококи поділяються на серогрупи (за полісахаридом), серотипи і серосубтипи (за білками зовнішньої мембрани), імунотипи (за ліпополісахаридом), пневмококи - на серотипи, гемофільна паличка - на серотипи (за полісахаридом), з яких найвірулентніший серотип b.
Як правило, поверхневі макромолекули патогенних бактерій, у тому числі збудників ГБМ, є, з одного боку, факторами вірулентності, що зумовлюють можливість колонізації організму людини і генералізації інфекції, і, з іншого боку, - мішенню для специфічних і неспецифічних захисних систем людини. Тому визначення серогруп, серотипів, імунотипів бактерій дозволяє прогнозувати результат їх взаємодії із системами вродженого і набутого, у тому числі вакцинального, імунітету і є істотним елементом епідеміологічного нагляду.
Обмеження серологічних методів. Взаємодіючи із системами імунітету, поверхневі молекули піддаються найсильнішому селекційному тиску. Механізми, що приводять до фазових варіацій, мутацій, рекомбінацій, горизонтальному переносу генів забезпечують широку варіабельність поверхневих макромолекул і приводять до відсутності чіткого взаємозв'язку імунотипу штаму з його еволюційним походженням і клональною належністю: родинні штами можуть мати різні серотипи, в той час як, штами, що мають однаковий серотип, не обов'язково є еволюційно близькими.
Істотним обмеженням серологічних методів типування є необхідність виділення живої культури бактерій, що далеко не завжди можливо. Крім того, реагенти для серотипування (специфічні антитіла) в Україні не виробляються, а вартість закордонних реагентів велика, тому серотипування збудників ГБМ не проводиться. Практичні установи з метою епіднагляду проводять серогрупування менінгококів.
6.2. Реакція аглютинації на склі (див. інструкцію по застосуванню сироваток)
Реакція аглютинації в полістиролових панелях
При серологічному групуванні штамів менінгококів, особливо з носоглотки, часто спостерігається ауто- або поліаглютинація. Щоб зняти це явище, необхідно при постановці РА використовувати мікробну суспензію. Для цього рекомендуються полістиролові панелі або велике скло, на якому краплі обмежують олівцем по склу. Для кожної досліджуваної культури менінгококів використовують 1 ряд лунок панелі. Число горизонтальних лунок відповідає числу аглютинуючих групоспецифічних сироваток. Рідку сироватку кожної серогрупи у лунці розводять вдвічі (до 1 краплі сироватки додають 1 краплю суспензії культури). В окремій лунці кожного ряду готують суспензію досліджуваної культури. Необхідна густина суспензії досягається зливним ростом колоній на 1/8-1/10 частині чашки Петрі. Запаяною зігнутою пастерівською піпеткою бактеріальну масу знімають, ретельно емульгують, спочатку в 2-х краплях фізіологічного розчину, внесеного раніше в лунку. Потім для одержання оптимальної робочої густини до суспензії додають до 1,0 куб. см фізіологічного розчину. Суспензію розносять по одній краплі в горизонтальні лунки. Панелі струшують протягом 1 хвилини руками або на апараті для струшування.
Специфічну реакцію виявляють та враховують протягом 3 хвилин. Пізніший облік не виключає наявності реакції за рахунок перехресно реагуючих антигенів. Контролем служить лунка, в якій готують початкову суспензію бактерій у фізіологічному розчині.
Висновок про належність культури до тієї або іншої серогрупи роблять на основі позитивної реакції аглютинації з відповідною сироваткою по 4-хрестовій шкалі (при відсутності аглютинації в фізіологічному розчині).
При наявності реакції аглютинації з декількома сироватками тест повторюють. Для цього беруть культуру з іншого сектору зливного росту колоній, ставлять реакцію з сироватками, що взяті в розведенні 1:2; 1:4 і, в разі підтвердження попередніх результатів, досліджуваний штам визнають як поліаглютинабельний. У відповіді вказують з якими сироватками спостерігалась позитивна реакція і в яких титрах.
Якщо повторення реакції аглютинації дало інші результати, тобто культура реагувала тільки з однією сироваткою, роблять висновок про наявність клітин, що чітко групуються, і поліаглютинабельних клітин.
Визначення належності пневмококів до того чи іншого серотипу проводять за допомогою РА в пробірках з бульйонною культурою і сироваткою в розведенні 1:5 (див. "Інструкцію по використанню сироваток...")
В цій же реакції або в реакції аглютинації на склі з полі- та монотиповими сироватками визначають належність до певного серотипу H. influenzae.
7. Визначення чутливості до антибіотиків
Для визначення чутливості до антибіотиків використовують стандартний дискодифузійний метод. Можна використовувати для визначення мінімальної подавляючої концентрації метод серійних розведень у середовищі та метод Е-тестів. Крім того, чутливість виділених культур можна вивчати за допомогою автоматичних аналізаторів (наприклад, Vitek) або молекулярно-генетичними методами.
Визначення чутливості ентеробактерій та стафілококів до антибіотиків проводять на середовищі АГВ або Мюллер-Хінтона. Ці середовища служать основою для визначення чутливості до антибіотиків менінгококів при додаванні 20% сироватки або 5% крові, та пневмококів - при додаванні 5% крові, чутливість до антибіотиків гемофілів слід вивчати на НТМ-агарі (Haemophylus Test Medium). Якщо кількість колоній, що виросла, мала , їх відсівають на чашку з відповідним поживним середовищем (кров'яним, сироватковим або "шоколадним" агаром) для накопичення мікробної маси.
При проведенні досліджень чітко дотримуються вимог стандартної методики внутрішнього контролю постановки тесту (табл. 6).
Слід зазначити, що визначення чутливості до S. pneumoniae має деякі особливості:
- Визначати чутливість їх до бета-лактамних антибіотиків (пеніциліну, амінопеніцилінів, цефалоспоринів, карбапенемів) не можна методом дисків, використовувати слід метод розведення в бульйоні або Е-тестів;
- Неможливо визначити чутливість пневмококів до антибіотиків методом розведення в агарі.
Вивчення чутливості до антибіотиків штамів H. influenzae має свої особливості.
- Для дослідження чутливості до антибіотиків H. influenzae не можна використовувати АГВ, в тому числі і як основу для приготування "шоколадного агару".
- Посів на чашки необхідно проводити протягом 15 хвилин після приготування інокулюму. Для інокуляції використовують стерильний ватний тампон, який занурюють у суспензію, відтискають надлишок об стінки пробірки і наносять на поверхню агару штрихами у трьох напрямках під кутом 60 град.
- Засіяні чашки термостатують при 37 +- 1 град. С в умовах
підвищеної концентрації СО (5-10%).
2
8. Терміни видачі відповіді та її формулювання
8.1. При бактеріологічному дослідженні ліквору та крові терміни видачі відповіді такі:
- в 1-й день на основі прямої бактеріоскопії ліквору та "товстої краплі" крові дають попередню відповідь, яка в залежності від результатів формулюється в 3 варіантах:
а) при наявності в мазках великої кількості морфологічно типових бактерій пишуть: "В спинномозковій рідині (крові) при прямій бактеріоскопії виявлені грамнегативні коки (або грампозитивні коки, грамнегативні палички), схожі по морфології з менінгококами (пневмококами, H. influenzae або іншими). Дослідження продовжується.";
б) при наявності в мазках поодиноких бактерій пишуть: "В спинномозковій рідині (крові) при прямій бактеріоскопії виявлені поодинокі (або парні) клітини коків (або паличок і т.п.). Дослідження продовжується.";
в) при відсутності будь-яких бактеріальних клітин пишуть: "В спинномозковій рідині (крові) при прямій бактеріоскопії бактерій не виявлено."
На 2-й день видають також попередню відповідь, яка, в залежності від результатів бактеріологічного дослідження, формулюється таким чином:
а) при наявності росту бактерій, типових за морфологічними та культуральними властивостями для нейсерій та інших родів пишуть: "При прямому посіві спинномозкової рідини (крові) отримано ріст нейсерій (або стрептококів, грамнегативних паличок та ін.). Вивчення культури продовжується.";
б) при відсутності росту пишуть: "При прямому висіві спинномозкової рідини (крові) росту бактерій не виявлено. Дослідження продовжується.".
На 3-й день на підставі культурально-біохімічних та серологічних властивостей бактерій, що відсіяні з чашки на другий день, видають відповідь: "Із спинномозкової рідини (крові) виділена культура менінгококів серогрупи А, В або ін. (або інша культура)". В рідкісних випадках - "M.(B.) catarrhalis".
В цей же день може бути видана попередня відповідь про ріст (або його відсутність) в результаті висіву із середовища збагачення. Формулювання таке ж, як і при оцінці результатів прямого посіву з чашки. В цей же день видають остаточну позитивну відповідь на пневмококи, яка формулюється так: "Із спинномозкової рідини (крові) виділена культура S. pneumoniae.".
На 4-й день може бути видана заключна позитивна відповідь про видову належність нейсерій, що виросли при прямому посіві, а також інших бактерій.
На цьому ж етапі, як і в наступні дні (аж до 7-8 дня), може бути видана заключна позитивна відповідь, одержана в результаті висіву із середовища збагачення. Формулювання таке ж (див. 3-й день).
Заключну негативну відповідь видають не раніше 8-го дня, коли при останньому висіві із середовища збагачення (на 7-й день його інкубації) не виявляють росту бактерій. Її формулювання: "При інкубації спинномозкової рідини (крові) на середовищі збагачення протягом 7 днів виділити бактерії не вдалося".
8.2. При бактеріологічному дослідженні відбитків-мазків з петехій хворого або шматочків тканини трупного матеріалу дають попередню відповідь, яка в залежності від результатів, формулюється в трьох варіантах (п. 8.1.).
