Позначення:
К - утворення кислоти;
(-) - рідко
* - тест використовують як додатковий при диференціації непатогенних нейсерій.
Додаток 2
ПРИГОТУВАННЯ
поживних середовищ та індикаторів
Загальні вимоги до виготовлення поживних середовищ викладені в ГОСТ 10444.1-84.
З метою підвищення достовірності та якості досліджень перевагу слід віддавати поживним середовищам та діагностичним препаратам промислового виробництва.
У випадку відсутності готових комерційних поживних середовищ, середовища готуються за пропонованою рецептурою.
Згідно сучасних вимог для приготування поживних середовищ замість дистильованої води використовують воду очищену.
Дату приготування та результати контролю якості поживних середовищ реєструють в "Журналі приготування та контролю поживних середовищ" (ф. № 256/0).
1. Сироватковий агар
За основу використовують комерційний МПА, рН - 7,4, амінний азот 150-180 мг/куб. см. Як основу можна використовувати середовище АГВ. До 80 куб. см розплавленої та охолодженої до температури 50 град. С агарової основи додають 20 куб. см інактивованої при температурі 56 град. С протягом 30 хвилин сироватки, консервованої хлороформом або без консерванту (при інактивації сироватки консервант зникає). Після перемішування середовище розливають в чашки. Середовище придатне до вживання протягом 48 годин при зберіганні його в холодильнику. Перед посівом чашки, що зберігалися в холодильнику, підігріваються до температури (37 +- 1) град. С.
Для поліпшення росту менінгокока можна разом з сироваткою додавати 2 куб. см 40% розчину стерильної глюкози. В цьому випадку для приготування агарової основи треба збільшити наважку для 100 куб. см дистильованої води на сухого середовища (МПА або АГВ).
1.1. Сироватковий агар з ристоміцином
До 80 куб. см розплавленого та охолодженого агарового середовища додають 20 куб. см сироватки та 0,1 куб. см розчину ристоміцину, що містить 20 000 МО/куб. см (залишкова концентрація антибіотика 20 МО/куб. см поживного середовища). Препарат розводять стерильним фізіологічним розчином до робочої концентрації, розливають у стерильні пеніцилінові флакони або центрифужні пробірки під ватними або гумовими пробками та заморожують в морозильній камері до використання. Кількість робочого розчину у флаконах або пробірках залежить від потреби лабораторії.
В разі необхідності розчин розморожують та додають до середовища. Наприклад, у флакон, що містить 100 000 МО ристоміцину, вносять 5 куб. см стерильного фізіологічного розчину. Одержане розведення препарату є робочим. Його зручно розлити по 0,5 куб. см та заморозити. В такому стані препарат може зберігатися декілька місяців.
1.2. Сироватковий агар з лінкоміцином
До 80 куб. см розплавленого та охолодженого агару додають 20 куб. см сироватки та 0,5 куб. см розчину лінкоміцину в концентрації 1000 мкг/куб. см. Залишкова концентрація антибіотика в середовищі - 5 мкг/куб. см поживного середовища. Розчин лінкоміцину зберігають при температурі (6 +- 2) град. С протягом 6 місяців.
2. Кров'яний агар
Кров'яний агар готують на тих же поживних основах, що і сироватковий агар. До розплавленого та охолодженого до температури 50 град. С агару додають 5% дефібринованої крові (барана, кроля або коня), ретельно змішують, уникаючи утворення піни та пузирів, і розливають в чашки Петрі.
Кров людини для приготування середовища використовувати не бажано!
3."Шоколадний" агар (кип'ячений)
Для приготування може бути використана кров барана, кролика або коня. Кров інших тварин може містити Н-антифактор, який необхідно інактивувати шляхом кип'ятіння. Кров людини для приготування середовища не придатна!
Це середовище можна готувати декількома способами:
1) Поживний агар з рН 7,3-7,4 розплавляють, охолоджують до температури 50 град. С. Стерильно додають 10-15% нативної або дефібринованої крові. Ретельно перемішують і ставлять на водяну баню при температурі 100 град. С на 5 хвилин. Вдруге перемішують і ставлять на водяну баню при температурі 100 град. С на 2-3 хвилини. Знову ретельно перемішують і залишають у водяній бані при 70-80 град. С на одну годину. Після цього охолоджують до 45-50 град. С, додають 5% дріжджового екстракту або стимулятор росту типу "Полівітекс", "Ізовіталекс", ретельно розмішують і розливають в чашки Петрі.
2) Поживний агар з рН 7,3-7,4 розплавляють, охолоджують до температури 50 град. С. Стерильно додають 5% нативної або дефібринованої крові. Ретельно перемішують і ставлять на водяну баню при температурі 100 град. С на 3 хвилини. Вдруге додають 5% крові, перемішують і ставлять на водяну баню при температурі 100 град. С на 3 хвилини. Після цього охолоджують до 45-50 град. С, додають 5% дріжджового екстракту або стимулятор росту типу "Полівітекс", "Ізовіталекс", ретельно розмішують і розливають в чашки Петрі.
3.1. Шоколадний бульйон
Приготування середовища аналогічне такому для шоколадного агару, але основою його служить поживний бульйон.
За прописом на етикетці готують поживний бульйон. До нього додають 10% крові і 5% дріжджового екстракту. Прогрівають так як і в попередньому рецепті.
3.2. Середовище Левінталя
До розплавленої та охолодженої до 70 град. С агарової основи, виготовленої на комерційному МПА, додають 10% дефібринованої крові. Ретельно перемішують і ставлять на вогонь увесь час струшуючи. При появі піни агар знімають з вогню. Повторюють таке кип'ятіння 3 рази. Відстоюють, прозору частину розливають стерильно у чашки Петрі або флакони.
Інший спосіб приготування цього середовища запропонував А.В. Шапіро. Після внесення крові середовище фільтрують через 4 шари марлі у сушильній шафі при 80 град. С протягом 30 хв. та розливають у чашки Петрі (пробірки).
4. Жовчно-сироватковий агар
При відсутності дисків з жовчу можна користуватись жовчно-сироватковим агаром.
сухої бичачої жовчі розчиняють в 100 куб. см дистильованої води, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, доводять рН до 7,2-7,4, стерилізують при (112 +- 2) град. С - 30 хв. До 80 куб. см розплавленого та охолодженого до температури 50 град. С поживного агару додають 4 куб. см стерильного розчину жовчі, перемішують, додають 20 куб. см сироватки тварин, знову добре перемішують і розливають у чашки Петрі. Залишкова концентрація жовчі в середовищі - 0,2%. Посів культур нейсерій проводять штрихами на сектори чашки.
5. Середовища з вуглеводами для визначення сахаролітичних властивостей нейсерій
До 75 куб. см агарової основи, якою може служити МПА, додають одного з вуглеводів (глюкоза, мальтоза, сахароза, левульоза або D-фруктоза) і 3,9 куб. см розчину індикатора фенолового червоного. Агар стерилізують при (112 +- 2) град. С - 30 хв. однократно. Перед вживанням середовище, що містить вуглеводи, розтоплюють на водяній бані, охолоджують до температури 48-50 град. С, додають 20% сироватки крові великої рогатої худоби і розливають у чашки. На одну чашку можна висіяти 6-8 культур (секторами). Таким чином, кожна культура засівається на 4 чашки з різноманітними вуглеводами.
Можна приготовані середовища розлити у пробірки по 6 куб. см і скосити їх. Посів робити на скошену поверхню.
Облік результатів проводять через 24 години інкубації в термостаті. При розкладанні вуглеводу з утворенням кислоти, червоний колір середовища в секторі цієї культури змінюється на яскраво жовтий. Із вказаних вуглеводів менінгокок розщеплює з утворенням кислоти глюкозу та мальтозу. При відсутності розщеплення зберігається вихідний червоний колір середовища.
6. Середовище для визначення продукції полісахаридів на агарі з 5% сахарози
До розплавленого і охолодженого до 50 град. С поживного агару з 5% сахарози додають 20% сироватки і розливають в чашки Петрі.
7. Середовище для тесту відновлення нітратів в нітрити
До 100 куб. см поживного бульйону pH 7,3-7,5, вільному від
нітритів (перевірити реактивом Грісса або Касаткіна), додають 0,1%
вільної від нітритів калійної селітри ( KNO ), перевіривши ще
3
раз на вміст нітритів, розливають по 5 куб. см в промиті
дистильованою водою не менше як 5 разів пробірки. Стерилізують
15 хвилин при (121 +- 1) град. С.
8. НТМ агар (Середовище для тестування гемофілів)
НТМ агар краще використовувати комерційний, оскільки його приготування трудоємке.
До розчиненої наважки (вказаної на етикетці) агару Мюллер-Хінтона додають дріжджовий екстракт до кінцевої концентрації 5 мг/куб. см і розчину гематину до кінцевої концентрації 15 мг/куб. дм.
Для приготування основного розчину гематину до порошку додають 100 куб. см 0,01N NaOH (0,01 моль/куб. дм) і нагрівають при ретельному перемішуванні до повного розчинення.
В підготовлене до автоклавування середовище на 1 куб. дм вносять 30 куб. см основного розчину гематину.
Після автоклавування і охолодження основи на водяній бані до температури 45-50 град. С в неї асептично вносять 3 куб. см матричного розчину НАД (нікотинамідаденіндинуклеотид) на 1 куб. дм агару до кінцевої концентрації 15 мг/куб. дм.
Для приготування матричного розчину 50 мг НАД розчиняють в 10 куб. см дистильованої води і стерилізують фільтрацією через мембранні фільтри з розміром пор 0,45 мкм.
При тестуванні триметоприму або ко-тримоксазолу слід додатково асептично внести 0,2 МО/куб. см тімідинфосфорилази.
Приготований агар розливають в стерильні чашки. На чашку діаметром необхідно 25 куб. см агару, діаметром 90 мм-20 куб. см для того, щоб товщина агару у чашці була 4 +- .
Агар застигає при кімнатній температурі. Чашки з застиглим агаром необхідно підсушити з прокритими кришками в термостаті при температурі 35 град. С протягом 10-30 хвилин для видалення надлишку конденсату.
9. Реактиви для визначення ферменту уреази за методом Заксе
Готується 2 реактиви: А і В.
РЕАКТИВ А: РЕАКТИВ В:
Сечовина - . 0,2% розчин фенолрот - 1 куб. см,
96 град. етиловий спирт - Однозаміщений фосфат калію
2 куб. см. (КН Р0 ) .
Дистильована вода - 2 4
4 куб. см. Двозаміщений фосфат калію
(К НР0 ) .
2 4
Хлористий натрій (NaCl) - .
Дистильована вода - 100 куб. см.
Реактив А не стерилізують і зберігають при температурі від (6 +- 2) град. С. Реактив В стерилізують в автоклаві текучою парою.
10. Реактив Грісса
Розчин № 1 - 0,8% сульфанілової кислоти в 5 N оцтовій кислоті.
Розчин № 2 - 0,6% диметилальфанафтаміну в 5 N оцтовій кислоті. Перед проведенням реакції змішують рівні об'єми розчинів № 1 і № 2.
Зберігати розчини слід в темному посуді з притертими кришками.
Пам'ятати! Реактив придатний для користування протягом 15 хв., безколірний, при появі рожевого забарвлення не використовувати.
11. Реактив Касаткіна
Розчин № 1 - 0,1%-ний розчин риванолу в дистильованій воді.
Розчин № 2 - 12%-ний розчин соляної кислоти (HCl).
Перед виконанням реакції змішують рівні об'єми розчинів № 1 та № 2. Реактивна суміш придатна для використання протягом 15 хвилин.
12. Індикатор феноловий червоний (фенолрот)
порошку фенолрот змішують з 16 куб. см 0,1N NaOH і витримують в термостаті до повного розчинення при частому струшуванні. Розчин доводять до об'єму 200 куб. см дистильованою водою, розливають у флакони і стерилізують при (121 +- 2) град. С 20 хв.
13. Водний розчин Люголя
Для приготування розчину Люголя беруть калія йодистого - , дистильованої води - 10 куб. см, йоду кристалічного - . Суміш ретельно укупорюють, залишають на добу, потім додають 300 куб. см дистильованої води.
14. Транспортні середовища для виділення менінгококів з носоглоткового слизу
Як середовища збагачення можна використовувати вірусологічні середовища Ігла або 199.
14.1. Бульйон для приготування змочених тампонів
Бульйон готують на будь-якій поживній основі з доданням 20% сироватки тварин та ристоміцину з розрахунку 20 МО/куб. см середовища. Використовують ватні тампони на алюмінієвих стержнях, вмонтовані в пробірку. Перед виїздом тампони стерильно змочують бульйоном (10-12 тампонів в 5 куб. см бульйону).
14.2. Рідке транспортне середовище з лінкоміцином
Використовують будь-який поживний бульйон або 2% пептонну воду, рН 7,2-7,6. До 100 куб. см стерильного бульйону додають 0,5 куб. см лінкоміцину в концентрації 1000 мкг/куб. см. Залишкова концентрація лінкоміцину 5 мкг/куб. см. Середовище зберігається при температурі (6 +- 2) град. С не більше 2 діб. Безпосередньо перед взяттям ротоглоткового слизу (можна в приміщенні, де знаходяться обстежувані особи) середовище розливається по 1 куб. см в стерильні пробірки. Перед зануренням тампону, пробку виймають, тампон вставляють у пробірку так, щоб матеріал був занурений в середовище; пробірку з вставленим тампоном знову закривають. Транспортують у вертикальному положенні при температурі не нижче +22 град. В лабораторії тампони відтискають об стінки пробірок, проводять посіви на сироватковий агар без антибіотиків в чашки Петрі. На одній чашці можна помістити 2 посіви.
14.3. Напіврідке середовище збагачення
До 80 куб. см напіврідкого поживного агару додають 20 куб. см сироватки та 0,1 куб. см розчину ристоміцину, що містить 20 000 МО/куб. см (залишкова концентрація 20 МО/куб. см поживного середовища). Розливають у пробірки по 3 куб. см, витримують 2 доби в термостаті для контролю, зберігають температурі (6 +- 2) град. С.
15. Диски з жовчу
Стандартні паперові диски для антибіотиків, або квадрати фільтрувального паперу розміром 5 х стерилізують, просочують стерильною жовчу великої рогатої худоби і після сушки в сушильній шафі при температурі 60 град. С (можна в термостаті або при кімнатній температурі протягом доби) поміщають у стерильну пробірку. Зберігають при температурі (6 +- 2) град. С 1 рік.
16. Диски з оптохіном
Стандартні паперові диски, попередньо простерилізовані, просочують оптохіном (етилгідрокупреїн гідрохлорид) в концентрації 1:1000-1:5000 (доза підбирається емпірично), висушують, як і диски з жовчу. Зберігають при температурі (6 +- 2) град. С 1 рік.
