Страница 2: Методичні вказівки з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів (45092)

Фактор X міститься в еритроцитах у вигляді термостабільної групи тетрапіролів, які входять до складу гематину та геміну та синтезується деякими мікроорганізмами (сарцини, стафілококи). Фактор V - термолабільний кофермент, який є складовою частиною вітамінів групи В. Обидва ці фактори присутні в крові, однак, у нативній крові барана або людини знаходяться ферменти (НАДази), здатні руйнувати V фактор. Тому V залежні гемофіли не ростуть або дають бідний ріст на кров'яному агарі.

Деякі види гемофільних бактерій патогенні для тварин і здатні викликати у них захворювання, інші - для людини. Із організму людини виділено 9 видів гемофілів, із них патогенними є H. influenzae та H. ducreyi (збудник м'якого шанкеру).

H. influenzae - типовий вид роду - каталазопозитивні, оксидазоваріабельні, редукують нітрати, розщеплюють глюкозу, мають уреазу, деякі штами виділяють індол, не утворюють сірководень. Обов'язковою умовою для росту є наявність у поживному середовищі свіжої крові (коня, барана), але самостійно H. influenzae нездатні лізувати еритроцити, тому, для вивільнення необхідних факторів росту, клітини крові руйнують при приготуванні поживного середовища (див. Методику приготування "шоколадного агару", середовища Левінталя). Антигенна структура H. influenzae включає антигени двох типів - капсульні і соматичні. За капсульним антигеном їх поділяють на 6 серотипів (a, b, c, d, e, f), які визначають при серотипуванні в РА з політиповими та монотиповими сироватками. Наявність капсули є основним фактором вірулентності. Більшість інвазивних інфекцій викликається штамами H. influenzae типу b (Hib). Капсула Hib складається із полірибозилрибітолфосфату (ПРФ), тобто містить у якості мономеру пентозу (рибозу) на відміну від інших типів, які містять гексозу, це, ймовірно, і визначає більш високий рівень їх вірулентності. Безкапсульні штами позначають як такі, що не типуються.

2.3. Пневмококи

S. pneumoniae є представником роду Streptococcus, родини Streptococcaceae, до якого належать грампозитивні, каталазо- і оксидазонегативні бактерії сферичної форми (коки) ледь видовжені (ланцетовидні). В мазках з нативного матеріалу розташовуються парами, кожна з яких оточена товстою капсулою. Капсула утворюється в живому організмі, а тому мікроскопія мазків з нативного матеріалу має діагностичну цінність. На простих поживних середовищах капсула утворюється тоненька, але її розвиток стимулює додавання крові або сироватки до поживного середовища. У мазках з поживних середовищ можуть розташовуватись ланцюжками і бути більш округлої форми. Пневмококи нерухливі, спор не утворюють. Структура клітинної стінки пневмококів типова для грампозитивних бактерій; для них характерна наявність потужної полісахаридної капсули, яка оберігає мікроорганізм від опсонізації та фагоцитозу. Вони є факультативними анаеробами, росту яких сприяє підвищена концентрація вуглекислого газу в атмосфері інкубації до 5-7%. Добре ростуть на кров'яних або сироваткових середовищах, доповнених 0,1% глюкозою. Здатні до лізису еритроцитів, викликаючи альфа-гемоліз на кров'яному агарі (КА). Оптимум росту 37 град. С. У присутності 6,5% NaCl не ростуть, чутливі до жовчі та оптохіну. Ферментативною активністю не відзначаються: здатні розщеплювати з утворенням кислоти лактозу, рафінозу, трегалозу; можуть утворювати альфа-галактозидазу. Вид S. pneumoniae серологічно не однорідний: за антигенами капсульних полісахаридів розрізняють 84 серотипи. Для серотипування пневмококів слід використовувати комерційні тест-системи для латекс-аглютинації та коаглютинації, які виявляють капсульний антиген.

3. Взяття і доставка матеріалу для лабораторного дослідження

Відбір клінічних зразків - важливий етап в ізоляції й ідентифікації бактеріальних агентів, які спричинили менінгіт. Клінічні зразки повинні бути отримані перш, ніж почата антимікробна терапія, щоб уникнути втрати життєздатності етіологічних агентів. Відібраний для дослідження матеріал повинен бути взятий в роботу в бактеріологічній лабораторії якомога швидше.

Спинномозкова рідина (СМР). Із спинномозкового каналу, лікар за допомогою люмбальної (міжхребетної) пункції стерильно, дотримуючись правил асептики, відбирає СМР в день госпіталізації хворого. Відбирають матеріал у 3 стерильні пробірки (по 1 куб. см мінімум; при можливості, по 3-4 куб. см): пробірка № 1 для біохімічних досліджень (визначення білка та глюкози); пробірка № 2 для бактеріологічних досліджень і пробірка № 3 для цитологічних досліджень (підрахунок клітин) і доставляють в лабораторію не пізніше 2 годин після забору. Якщо негайно доставити ліквор в лабораторію неможливо, то як виключення, його слід посіяти на чашки з шоколадним і кров'яним агарами та декілька крапель внести в середовище для контролю стерильності (тіогліколеве). Помістити посіви в термостат з температурою (37 +- 1) град. С і намагаються негайно відправити до лабораторії, але не пізніше 3-х годин після забору матеріалу. Замість середовища для контролю стерильності ВООЗ рекомендує використовувати триптиказо-соєвий бульйон з 0,025% натрію поліанетолсульфонату (Laboratory Manual for the Diagnosis of Meningitis Caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. WHO/CSR/EDC/99.7/)

Під час зберігання і транспортування відібраний матеріал оберігають від охолодження і висихання. Доставка здійснюється в контейнері з грілкою або в термосі.

Слиз носоглотки. Матеріал беруть натще або не раніше 2 годин після останнього прийому їжі. Для відбору матеріалу використовують стерильний ватний тампон закріплений на дротині, загнутий під кутом 135 град. ще до стерилізації. Шпателем, тримаючи його в лівій руці, притискають корінь язика, а правою рукою вводять тампон загнутим кінцем догори під м'яке піднебіння в носоглотку і легкими горизонтальними рухами зігнутого тампона під м'яким піднебінням збирають виділення - слиз. Витягати тампон треба дуже обережно, щоб не зачепити язик, щоку і не торкнутися зубів.

Відібраний носоглотковий слиз може бути засіяний на місці його взяття на відповідні поживні середовища (див. табл. 1), матеріал втирають в середовище з усієї площі тампона з подальшим розсівом бактеріологічною петлею для отримання ізольованих колоній по усій площі чашки. Оскільки слиз носоглотки містить різноманітну мікрофлору, яка може пригнітити ріст менінгококів, то до сироваткового агару (СА) додають антибіотики, що пригнічують ріст грампозитивних мікроорганізмів (ристоміцин або лінкоміцин).

Засіяні чашки доставляють в лабораторію, ретельно захищаючи їх від охолодження та висихання.

При дослідженні за епідпоказаннями та з профілактичною метою сіють матеріал на сироватковий агар з антибіотиками.

Відібраний слиз носоглотки може бути доставлений в лабораторію і на тампоні, який занурюють в пробірку з транспортним середовищем або середовищем збагачення. Крім того, матеріал можна відбирати на змочені тампони, які потім доставляють в лабораторію. При транспортуванні слизу носоглотки на короткі відстані (1-2 години їзди до лабораторії) використання транспортних середовищ не рекомендується. При транспортуванні протягом 2-2,5 годин доцільно використання змочених тампонів. Для транспортування протягом 3 годин і більше доцільно використання транспортного середовища.

Кров. Об'єм крові необхідний для бактеріологічного дослідження залежить від віку пацієнта: у дітей раннього віку (до 2 років) відбирають 1-2 куб. см, у старших дітей (до 14 років) - 2-5 куб. см, у підлітків та дорослих - 5-10 куб. см. Стерильно з ліктьової вени беруть відповідний об'єм крові. Декілька крапель засівають на чашки СА, КА та ША, а решту матеріалу - у флакон з 0,1% напіврідким агаром або тіогліколевим середовищем у співвідношенні 1:10. Замість середовища для контролю стерильності ВООЗ рекомендує використовувати триптиказо-соєвий бульйон з 0,025% натрію поліанетолсульфонату (Laboratory Manual for the Diagnosis of Meningitis Caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. WHO/CSR/EDC/99,7/). Одночасно роблять мазок та "товсту краплю" крові для бактеріоскопічного дослідження. Чашку і флакон доставляють в лабораторію, оберігаючи від охолодження.

Ексудат із петехій. Шкіру навколо петехії обтирають 70 град. спиртом. Набирають в шприц з тонкою голкою 0,1-0,2 куб. см фізіологічного розчину, який вводять в товщу петехії і відсмоктують назад. Зачохлюють голку і передають шприц з матеріалом до лабораторії, ретельно оберігаючи його від охолодження.

Трупний матеріал (кров, ліквор, шматочки мозку, уражені ділянки мозкових оболонок, уражень шкіри і т.і.), враховуючи низьку життєздатність менінгокока, є сенс брати для дослідження тільки в перші години після смерті, поки труп ще не захолов. За даними літератури на тканинах, до яких менінгокок має тропність, збудник може зберігатись у темноті до 4-5 діб.

Кров беруть стерильно із правого серця, після розтину скальпелем, за допомогою стерильної піпетки з грушею в кількості 7-10 куб. см. Із них 2-3 куб. см засівають в 25 куб. см 0,1% напіврідкого агару або тіогліколевого середовища, на СА, КА та ША, а залишки 5-7 куб. см використовують для інших досліджень (серологічних, в реакції зустрічного імуноелектрофорезу та ін.). Для посівів можна використовувати також згустки крові із великих судин.

Ліквор беруть стерильною піпеткою із міжоболонкового простору (під час виймання головного мозку з порожнини черепа), в стерильну пробірку в кількості 3-5 куб. см і негайно висівають на чашки з поживними середовищами (ША та КА). 0,1 куб. см досліджуваного матеріалу наносять в центр чашки і розподіляють по її поверхні похитуючи. Розтирати шпателем не рекомендується.

Бактеріологічні дослідження ліквору та крові проводять за описаною схемою. Треба мати на увазі, що ріст на чашках може бути змішаним із-за попадання іншої мікрофлори, тому до загальноприйнятого набору поживних середовищ треба додати чашку сироваткового агару з антибіотиком (ристоміцин, лінкоміцин).

Матеріал з мозкових оболонок беруть стерильним ватним тампоном і засівають газоном або штрихами на чашки з "шоколадним" та сироватковим агаром та в пробірку із середовищем збагачення, роблять 2 мазки, один з яких фарбують метиленовим синім, інший - за Грамом в модифікації Калини.

Для взяття матеріалу з мозку та інших органів до місця розрізу торкаються розжареним шпателем, матеріал беруть з глибини розрізу стерильним ватним тампоном. Посів проводять звичайним способом на ті ж тверді та рідкі поживні середовища. Культури, що виросли, диференціюють за описаною схемою (Таб. 2).

Крім посівів з мозку, доцільно проводити вивчення мазків-відбитків з поверхні м'яких мозкових оболонок. Після підсушування та фіксації у суміші Нікіфорова, мазки фарбують та переглядають.

Для серологічного дослідження використовують парні сироватки крові одержані: при госпіталізації (сироватка № 1) та на 10-15 дні від початку захворювання (сироватка № 2).

Контейнери з пробами чітко маркують, скріпляють разом від кожної особи і позначають номер у відповідності з направленням (ф. 204/О), з обов'язковим зазначенням дати і часу відбору матеріалу, прізвища лікаря і номера телефону, за яким можна сповістити про попередній результат дослідження.

Таблиця 1

Первинні середовища, необхідні для первинного

посіву матеріалу від хворих на менінгіти

4. Порядок проведення досліджень

Спинномозкова рідина (СМР). Мікробіологічне дослідження ліквору складається з бактеріоскопії мазка, виділення збудника та його ідентифікації, серологічної детекції антигенів у СМР. Ліквор досліджують негайно після доставки в лабораторію. Якщо рідина мутна, посів здійснюють без попередньої підготовки. Прозору рідину центрифугують 5 хвилин при 3000 об/хв, осад висівають та мікроскопують. З матеріалу готують мазок, висушують на повітрі, фіксують сумішшю Нікіфорова протягом 5 хвилин і фарбують метиленовим синім або за Грамом в модифікації Калини. Не можна фіксувати мазки в полум'ї пальника або спиртівки!

Бактеріоскопічне дослідження проводять уважно, ретельно переглядаючи як мінімум 20 полів зору, або до того часу, поки бактерії не будуть виявлені. Пряма мікроскопія дозволяє встановити наявність бактерій, що викликали захворювання.

N. meningitidis можуть розташовуватись поза клітиною або всередині лейкоцитів, за Грамом забарвлюються негативно, виглядають як диплококи схожі на зернини кави.