8.3. При бактеріологічному дослідженні слизу з ротоглотки видають тільки заключні відповіді. Терміни видачі та формулювання такі: на 4-й день при виділенні культури менінгококу видають позитивну відповідь: "У носоглотковому слизі виявлені менінгококи серогрупи..." (або такі, що не піддаються серогрупуванню).
У випадках додаткового відсіву колоній з чашок, а також при використанні напіврідкого середовища збагачення термін видачі відповіді затримується на один день.
При відсутності росту менінгококів в посівах видають негативну відповідь: "У носоглотковому слизі менінгококи не виявлені".
Увага! Згідно стандартам епіднагляду рекомендованим ВООЗ лабораторним підтвердженням випадку захворювання є:
- для менінгококової інфекції -
виявлення менінгококового антигену в спинномозковій рідині, або виділення культури збудника
- для Hib-інфекції -
виділення культури або виявленням антигену Hib у СМР або в крові. Виділення штаму Hib з нестерильних локалізацій - наприклад, з носоглотки, де бактерії можуть рости, не викликаючи захворювання, не є підтвердженням Hib-інфекції.
9. Генодіагностика гнійних бактеріальних менінгітів
У зв'язку з різноманітністю збудників менінгітів і великою різноманітністю антибактеріальних препаратів, особливого значення набуває рання розшифровка етіології захворювання.
Останнім часом, поряд з бактеріологічними і серологічними методами, широко використовуються молекулярно-генетичні дослідження, а саме, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), яка дозволяє виявити в СМР і крові фрагменти нуклеїнових кислот широкого спектру збудників. Застосування методів на основі ПЛР значно покращує діагностику ГБМ, не потребуючи присутності живих мікроорганізмів у досліджуваному матеріалі; вони мають вищу чутливість порівняно з класичними методами.
Принцип ПЛР полягає в багаторазовій ампліфікації генетичного матеріалу, що міститься в досліджуваному зразку, за допомогою ферменту термостабільної ДНК-полімерази. Для генодіагностики ГБМ як зразок (матеріал для дослідження) використовуються стерильні рідини організму людини, у першу чергу, спинномозкова рідина. Розмноженню й ідентифікації піддають фрагменти генома збудників ГБМ, тобто, в першу чергу, менінгококів, пневмококів, гемофільної палички.
У порівнянні з традиційними методами діагностики, генодіагностика відрізняється високою чутливістю і дозволяє використовувати для дослідження матеріал, який не містить живі збудники, а тільки фрагменти їх генетичного матеріалу.
Результати генотипування характеризуються більшою однозначністю в порівнянні з морфологічними, біохімічними чи імунологічними методами ідентифікації мікроорганізмів і надають безпосередню інформацію для з'ясування епідеміологічних зв'язків різних збудників.
Типування збудників ГБМ вкрай важливо для епідеміологічного нагляду, проведення протиепідемічних заходів, короткострокового і довгострокового епідеміологічного прогнозу.
Методи генодіагностики і генотипування не заміняють традиційних мікробіологічних методів, але є істотним і необхідним їх доповненням. Застосування генодіагностики і генотипування дозволяє підвищити рівень діагностики менінгококової інфекції і гнійних бактеріальних менінгітів і дає можливість більш повного епідеміологічного спостереження за поширеністю різних варіантів їх збудників на території країни.
Геномна ДНК збудників ГБМ являє собою досить велику кільцеву хромосому, так, наприклад, геном N. meningitidis складається з 2,3 мільйона пар основ і близько 2 160 генів. Функції багатьох генів ще невідомі, однак серед них можна виділити унікальні ділянки, специфічні для даного роду, виду, підвиду мікроорганізмів. Власне генодіагностика і полягає в розмноженні та визначенні подібності певної ділянки, що може бути зроблене за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.
В основі методу ПЛР лежить багаторазове копіювання за допомогою ферменту ДНК-полімерази певного фрагмента ДНК. Комплементарне добудовування послідовностей може початися тільки у визначених стартових блоках - коротких двониткових ділянках. Для створення стартових блоків у заданих ділянках ДНК використовують затравки, що являють собою спеціально синтезовані in vitro олігонуклеотиди довжиною близько 20-30 основ - праймери. Праймери комплементарні послідовностям ДНК на лівій і правій межах фрагмента, що ампліфікується, і орієнтовані таким чином, що синтез ДНК, здійснюваний ДНК-полімеразою, відбувається між ними. Процес ампліфікації полягає в повторі циклів, що складаються з денатурації ДНК, відпалювання праймерів і синтезу фрагмента ДНК, який проводиться при різній температурі на приладі з програмним контролем температурного режиму - термоциклері (ампліфікаторі). У результаті відбувається збільшення кількості копій специфічного фрагмента у геометричній прогресії. Після 30-35 циклів ампліфікації синтезується 108 копій фрагмента - ампліконів, що дає змогу визначення і візуалізації їх електрофоретичної рухливості в агарозному (акриламідному) гелі. Праймери можуть бути строго видоспецифічними або родоспецифічними.
Виділення та ідентифікація збудника зі зразків СМР або крові хворого класичними бактеріологічними методами, залишаючись "золотим стандартом" діагностики, має серйозні обмеження, обумовлені застосуванням антибіотиків на догоспітальному етапі. Крім того, бактеріологічна діагностика триває не менше 2 діб.
Перевагами ПЛР є - можливість виявлення навіть декількох копій генома бактерій у зразку і, як наслідок, максимальна діагностична потужність; чутливість і специфічність, що сягають 100%, висока відтворюваність; стиснуті (декілька годин) терміни дослідження. Тому показаннями до генодіагностики ГБМ є:
- негативні результати діагностики іншими методами;
- використання для діагностики зразків СМР, узятих після антибіотикотерапії або на пізніх стадіях хвороби;
- необхідність термінового діагностичного результату;
- заміщення вартісних імунологічних методів.
Прямих протипоказів до застосування генодіагностики ГБМ не існує. Однак, з одного боку, ПЛР здатна виявити мінімальне бактеріальне забруднення досліджуваного зразка; з іншого боку, у деяких біологічних рідинах, у тому числі, СМР можлива присутність інгібіторів ПЛР. Тому при постановці реакції обов'язковим є використання позитивних і негативних контролів, висока якість усіх реагентів і їх періодична перевірка, акуратність і ретельність виконання дослідження, що дозволяє уникнути як хибно-позитивних, так і хибно-негативних результатів.
Основні вимоги до організації роботи ПЛР лабораторій викладені в ДСП 9.9.5.-080-2002. Лабораторія ПЛР-діагностики повинна бути укомплектована кваліфікованим персоналом, мати відповідні приміщення, устаткування і витратні матеріали, необхідні для виконання трьох основних етапів дослідження методом ПЛР: виділення ДНК із досліджуваного матеріалу, постановки реакції ампліфікації, обліку результатів ампліфікації. Для запобігання контамінації важливо проводити кожен етап в окремому, спеціально обладнаному приміщенні. Один і той же працівник не повинен бути задіяний на різних етапах роботи протягом одного робочого дня.
Забір і зберігання зразків біологічного матеріалу. Забір, зберігання та доставка зразків до лабораторії проводиться з дотриманням правил асептики і біологічної безпеки при роботі з інфекційним матеріалом (ДСП 9.9.5.-080-2002). Приготований з біологічних зразків чистий препарат ДНК не вважається інфекційним.
Зразки СМР забирають у хворих на ГБМ, бажано при госпіталізації в стаціонар, у рамках звичайної діагностичної спинномозкової пункції. Для запобігання хибно-позитивних результатів рекомендується використання одноразових голок для пункції і стерильних одноразових пробірок типу "Епендорф". Як правило, для ПЛР-діагностики достатньо 0,1-0,5 куб. см СМР. Використання інших асептично узятих зразків (кров, аутопсійні матеріали) можливе, але при ГБМ має менше значення.
Відібрані зразки СМР можуть бути досліджені методом ПЛР негайно, зберігатися протягом 1-3 днів при (6 +- 2) град. С, або бути піддані глибокому заморожуванню. При -20 град. С зразок може зберігатися кілька місяців, при -70 град. С практично необмежено. Варто уникати декількох циклів заморожування-розморожування зразка, тому, якщо зразок планується досліджувати неодноразово, аліквоти повинні бути розлиті в окремі пробірки.
Виділення ДНК. Зразки СМР можна використовувати в реакції ампліфікації безпосередньо; перед дослідженням проби (100 мкл СМР, покриті зверху 100 мкл мінеральної олії) інкубують в термостаті для мікропробірок 20 хвилин при 99 град. С з метою руйнування бактерій, після чого центрифугують при протягом 1 хвилини при кімнатній температурі і супернатант відбирають для постановки ПЛР. Концентрацію і чистоту ДНК у подібній пробі можна підвищити, додавши етап виділення шляхом сорбції. При цьому, щоб переконатися, що в кожному зразку СМР виділення ДНК пройшло успішно, у зразок СМР перед виділенням ДНК додається внутрішній контроль - препарат ДНК, наприклад, вірусу гепатиту В (HBV), а також готується додаткова пробірка без СМР, але з HBV, що являє собою негативний контроль виділення. Надалі для кожного зразка СМР ставиться реакція на виявлення ДНК HBV, що повинна дати позитивні результати.
Для виділення ДНК використовується свіжа культура бактерій, що вирощена на твердих поживних середовищах з одиночної колонії. Необхідна кількість матеріалу, як правило, одна чи кілька колоній, переноситься стерильною одноразовою петлею в стерильну одноразову пробірку з очищеною стерильною водою або фізіологічним розчином, що не містить навіть слідових кількостей бактеріальної ДНК. Безпосередньо для цілей ПЛР-діагностики препарати з виділених культур використовуються рідко, оскільки в цих випадках можлива діагностика стандартними мікробіологічними методами. Проте, чисті культури можуть бути використані для генотипування, перевірки специфічності і чутливості праймерів і тест-систем у цілому, а також у якості позитивного або негативного контролів.
ДНК із бактеріальної суспензії виділяється стандартними методами лізису/сорбції/відмивання (наприклад, з використанням наборів "ДНК-сорб", ЦНДІ епідеміології, Москва, Росія) або фенол-хлороформної екстракції. Концентрації ДНК у пробі при необхідності можна визначити спектрофотометрично при довжині хвилі 260 нм. Число мікроорганізмів, еквівалентних даній концентрації ДНК, розраховується виходячи з приблизного співвідношення: 1 бактеріальна клітина містить 4 фемтограма ДНК.
Для визначення родових ознак Neisseria, Streptococcus і Haemophilus може бути використаний ген бактеріальної 16S рибосомальної РНК. Специфічні "серогрупові" праймери розпізнають наступні гени менінгококів: для серогрупи А - унікальний ген, що кодує УДФ-N-ацетил-d-глюкозамін-2-епімеразу (mynA), для серогруп В і С - гени, що кодують полісіалілтрансферазу-D (siaD). Ці гени беруть участь у синтезі полісахаридів капсули менінгококів і праймери здатні диференціювати менінгококи серогрупи B від менінгококів серогрупи C (а також W135, Y, і інших). Теоретично праймери здатні визначити серогрупу менінгокока більше, ніж у 90% випадків захворювання, оскільки сумарно менінгококи серогруп А, В та С відповідальні більше, ніж за 90% випадків МІ в Україні. Результат ПЛР із серогруповими праймерами є додатковою перевіркою і підтвердженням вірності результатів, отриманих з родоспецифічними праймерами.
Для підвищення ефективності ампліфікації використовується методика "гарячого старту".
Аналіз і облік результатів. Продукти ампліфікації виявляються і диференціюються методом електрофорезу в 2% агарозному гелі, що містить бромистий етидій, з подальшою візуалізацією при підсвічуванні гелю ультрафіолетовим випромінюванням. Довжина ампліфікованого фрагмента гена 16S РНК Neisseria - 341 пара нуклеотидів, Haemophilus - 516 п.н., Streptococcus - 792 п.н., довжина специфічних ампліконів N. meningitidis серогрупи А - 349 п.н., групи В - 539 п.н., С - 209 п.н. Фіксацію, збереження та аналіз отриманих зображень гелів зручно проводити за допомогою спеціалізованих систем обробки зображення (Gel-Doc, БиоРад; BioTest, ЦНДІ епідеміології). При невеликому обсязі досліджень можливі і безпосередня візуальна оцінка та фотографування результатів.
Облік результатів. На доріжці (доріжках), яка відповідає позитивному контрольному зразку (зразкам), повинна бути яскрава специфічна смуга, яка світиться, на рівні довжин ампліконів, зазначених вище. Довжина амплікону визначається по додатковій доріжці, що містить маркер довжини. Позитивними вважаються зразки (клінічні проби), що містять специфічну смугу, яка світиться, більшої чи меншої інтенсивності, на тому ж рівні, що й позитивний контроль. Негативними вважаються зразки, у доріжках яких немає подібних смуг. У доріжці, що відповідає негативному контрольному зразку, не повинно бути високомолекулярних смуг (вище рівня 100 п.н.)
Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:
- Якщо в доріжці, що відповідає позитивному контролю, відсутня специфічна смуга. Причиною цього могла бути помилка в приготуванні реактивів, постановці ПЛР або збій програми ампліфікатора.
- Якщо в негативному контролі виявляється специфічна смуга, це означає, що у процесі роботи сталася контамінація реактивів або проб позитивною ДНК або продуктами її ампліфікації. У цьому випадку результати аналізу в усіх пробах вважаються недійсними. Для перевірки реактивів необхідно поставити не менше трьох негативних контролів на етапі виділення ДНК і стільки ж на етапі постановки ПЛР (без пробопідготовки) для виявлення джерела контамінації. Якщо недостовірний результат повторився хоча б один раз, необхідно замінити реактиви.
Крім того, молекулярно-генетичні дослідження можуть бути використані для вирішення не тільки діагностичних, але й багатьох епідеміологічних питань: короткострокове і локальне розслідування спалахів, глобальний довгостроковий епіданаліз. З цією метою можуть бути використані наступні способи ідентифікації амплікона: гель-електрофорез (специфічний амплікон повинен мати певну довжину і відповідну електрофоретичну рухливість); рестрикційний аналіз (амплікон піддається дії ферментів рестриктаз, які розрізають його на характерне число фрагментів певної довжини); ПЛР із імуноферментним детектуванням (аналог ІФА при якій амплікон зв'язується зі специфічним зондом) та інші.
