Страница 2: ГОСТ 20235.2-74. Мясо кроликов. Методы бактериологического анализа (73560)

Для приготовления селенитовой среды к 50 см³ раствора А сте­рильно добавляют 2 см³ раствора Б. Среду разливают в стериль­ные пробирки по 5—7 см³, но не стерилизуют.

Среду готовят из трех основных растворов А, В и С.

Для приготовления раствора А в 90 см³ дистиллированной воды растворяют 0,42 г пептона, 0,7 г хлористого натрия, 0,15 г одноза­мещенного фосфорнокислого натрий, 2 мл дрожжевого диализата.

Для приготовления раствора В в 9 см³ дистиллированной воды растворяют 3,6 г кристаллического хлористого магния.

Раствор С состоит из.0,09 см³ 5%-ного водного раствора брил­лиантовой зелени.

Для приготовления хлористомагниевой среды «М» (модифици­рованной) растворы А, В и С смешивают и стерилизуют 30 мин при температуре 112,5’С.

Концентрированную среду готовят, удваивая содержание всех компонентов, кроме дистиллированной воды.

При отсутствии дрожжевого диализата допускается применять дрожжевой экстракт.

В 2000 мл дистиллированной воды растворяют 1000 г прессо­ванных хлебопекарных дрожжей. Полученную суспензию стерили­зуют 30 мин текучим паром, затем отстаивают в холодильнике при температуре 4—6°С в течение пяти-шести суток.

Жидкость над осадком декантируют, приливают 2,5 см³ 0,01%-ного раствора кристаллвиолета, разливают во флаконы или пробирки и вновь стерилизуют при температуре 100°С в течение 30 мин. Экстракт хранят в холодильнике при температуре 4—6°С в течение двух недель.

К 100 мл холодной дистиллированной воды прибавляют 5 г порошка сухой среды Эндо, тщательно размешивают, нагревают при помешивании до полного расплавления агара, кипятят на сла­бом огне 3—5 мин, не допуская пригорания. Горячую среду филь­труют через рыхлый ватный, предварительно смоченный дистилли­рованной водой и отжатый фильтр и вновь доводят до кипения.

После остывания среду разливают в стерильные чашки Петри слоем 4—5 мм и после застывания подсушивают в термостате. Чашки со средой, во избежание ее покраснения, нельзя оставлятьСтр. 9 ГОСТ 2023S.2—74

на солнечном свету. Среду готовят непосредственно перед ана­лизом.

В 100 см³ холодной дистиллированной воды тщательно разме­шивают 6 г порошка сухой среды Плоскирева, нагревают при помешивании до полного расплавления агара, кипятят на слабом огне 2—3 мин, не допуская пригорания, до образования быстро оседающей крупнопузырчатой пены. Горячую среду разливают в стерильные чашки Петри слоем 4—5 мм и оставляют их открыты­ми на 40 мин для остывания и подсушивания, после чего чашки закрывают крышками или картонками и среда готова к посеву.

В 100 см³ холодной дистиллированной воды тщательно разме­шивают 6 г порошка сухого висмут-сульфитного агара, кипятят на слабом огне 3—5 мин при закрытой крышке или пробке, не допуская пригорания.

После остывания среду разливают в стерильные чашки Петри слоем 4—5 мм, предварительно взболтав для равномерного распре­деления остатка. Чашки Петри оставляют открытыми на 40 мин для остывания и подсушивания.

К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 1 г пептона, 0,5 г хлористого натрия и нагревают до растворения, затем фильтруют до тех пор, пока раствор не станет совершенно прозрачным. Уста­навливают pH 7,0, прибавляют 0,5 г углерода и 1 см³ индикатора Андреде.

Среду разливают по 5 см³ в пробирки с поплавками и стерили­зуют 20 мин при температуре 110°С. Среда должна быть бесцвет­ной или соломенно-желтого цвета, без розового оттенка. Можно использовать готовые среды Гисса.

Для приготовления индикатора Андреде к 100 см³ дистиллиро­ванной воды добавляют 16 см³ 1 н. раствора гидрата окиси натрия и 0,5 г кислого фуксина. Раствор стерилизуют 5 мин при темпера­туре НО—112°С. Среду хранят в склянке из темного стекла.

К 1000 см³ дистиллированной воды добавляют 10 г "пептона и 5 г хлористого натрия, кипятят до растворения пептона, филь­труют и устанавливают pH 7,2—7,4, после чего стерилизуют 30 мин при температуре 120°С.

К 100 см³ расплавленного мясо-пептонного агара (pH 7,2), при­готовленного по п. 3.2.4, добавляют 0,5 мл 10 %-ного водного рас­твора хлористого железа, стерильно разливают в пробирки стол­биком и немедленно охлаждают.

К 1000 см³ дистиллированной воды прибавляют 1 г пептона, 5 г хлористого натрия, 1 г глюкозы, 2 г фосфорнокислого однозаме- апенного калия, 6 см³ фенолового красного (1 :500) и 20 г мочеви­ны и нагревают до полного растворения солей.

Среду фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают pH >6,8—6,9, разливают в пробирки по 5—6 см³ и стерилизуют на водя­ной бане по 15—20 мин трое суток подряд. Готовая среда бесцвет­ная. Особое внимание необходимо обращать на pH среды.

В 1000 см³ горячей дистиллированной воды растворяют 5 г дву­замещенного фосфорнокислого натрия, 7 г пептона, 5 г глюкозы, •фильтруют и устанавливают pH 6,9—7,0. Среду разливают в про­бирки по 5 см³ и стерилизуют в водяной бане по 15 мин ежеднев­но трое суток подряд. Готовая среда должна быть бесцветной и прозрачной.

В 40 см³ дистиллированной воды растворяют 1 г бромтимол­блау, нагревают до кипения и добавляют 25 см³ 0,1 н. раствора гидрата окиси калия, в результате чего жидкость приобретает зеленоватый оттенок. Затем дистиллированной водой доводят объ- <ем до 500 см³. Индикатор хранят в темной склянке с притертой пробкой.

В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 5 г хлористого «атрия, 0,2 г сернокислого магния, 1,5 г фосфорнокислого натрия- аммония, 2 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 5 г ней­трального лимоннокислого натрия, 20 г агара-агара. Раствор филь­труют, добавляют 40 см³ раствора бромтимолблау (1 :500). Среду разливают в пробирки по 5—6 см³, стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 мин, после чего скашивают. Готовая среда должна быть оливкового цвета.

К 1000 мл дистиллированной воды прибавляют 3 г дрожжевого экстракта, 2—1 г DL или L-фенилаланина, 1 г двузамещенного «фосфорнокислого натрия, 5 г хлористого натрия, нагревают при .постоянном помешивании до полного растворения добавленных компонентов. Затем устанавливают pH 7,2—7,4 и добавляют 12 г .агара. После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. Приго- -товленный агар фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют 10—15 мин в автоклаве при температуре 121°С. После стерилиза­ции питательную среду скашивают.

К мясо-пептонному бульону, приготовленному по п. 3.2.2, до­бавляют 0,5% агара. Среда должна иметь pH 7,0—7,2. Среду сте­рилизуют 20 мин при температуре 120°С.

В пробирку вносят 2 см³ 5 %-ного раствора лимоннокислого натрия и 8 см³ только что полученной крови кролика. Цитратную vrtATlIL. nTQDQT 13 □ 1 Я —ОП U П ПЛ ПИ TTKWUV TTT4W ТРМТЇРГіятиг>р 4--

n.UUt5Jt> V і £1X5 Л 1 ДІЇ 1 О £»j Ч P ЛилиДИ «/1 X5X1 Ил НуИ 1 Vlvlli vpa 1 V pc V w

или подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 15 мин. В результате чего над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета — плазмы, которую разводят физиологическим раствором 1: 4.

В колбу со стеклянными бусами сливают 8 см³ только что взя­той крови кролика и непрерывно встряхивают в течение 10— 15 мин, в результате чего находящийся в крови фибрин выпадает в осадок и обволакивает бусы; Дефибринированную кровь слива­ют в другую колбу или пробирку. Слитая дефибринированная кровь утрачивает способность свертываться.

В стерильный растопленный 2%-ный мясо-пептонный агар, приготовленный по п. 3.2.4 или по п. 3.2;5, добавляют натриевую соль дезоксирибонуклеиновой кислоты из расчета 2 г на 1 см^ среды. Перед добавлением дезоксирибонуклеиновой кислоты рас­творяют в дистиллированной воде, содержащей три—пять капель 1 н. раствора гидрата окиси натрия. Среду стерилизуют ЗО мив в водяной бане. В среду добавляют хлористый кальций из расчета 0,8 мг на 1 см³, разливают в чашки и подсушивают на воздухе. Среда должна иметь pH 8,6.

К 100 мл расплавленного стерильного мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.2.4 и охлажденного до температуры 45°С, стерильно прибавляют 5—10 см³ дефибринированной стерильна взятой крови лошади, кролика или барана. Готовую среду разли- вают в стерильные чашки Петри, дают ей застыть и подсушивают в термостате при температуре 37°С. Слой агара должен быть рав> номерно окрашен в красный цвет.

500 г говяжьей печени режут на куски массой по 30—40 г, заливают водой и кипятят в течение 15—20 мин. Воду сливают, куски печени разрезают на кусочки массой 1,5—3,0 г, заливают водой, подщелоченной двууглекислым натрием до pH 7,2—7,4, и кипятят в течение 10—15 мин, не допуская бурного кипения. Об­щее количество добавленной воды 1000 см³. Затем печень промы- 22вают в дуршлаге под струей воды в течение 1 ч и два-три раза дистиллированной водой.

Кусочки печени раскладывают во флаконы, заливают водой и стерилизуют 20 мин при температуре 120°С.

Для приготовления среды Китт-Тароцци пробирки заполняют на 1,0—1,5 см кусочками печени, заливают мясо-пептонным бульо­ном, приготовленным по п. 3.2.2, с добавлением 1 г глюкозы. Высота слоя бульона 6—7 см в обычных пробирках, 9—10 см — в высоких. На поверхность среды в пробирке перед стерилизацией наслаивают 0,5—1 см³ вазелинового масла. Стерилизуют 20 мин при температуре 120°С.

На дистиллированной воде готовят 20%-ный раствор сернова­тистокислого натрия и 8%-ный раствор хлористого железа. Оба раствора кипятят.

100 см³ 3%-ного мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.2.4 или п. 3.2.5, растапливают на водяной бане и добавляют 1 г глюкозы, 10 см³ 20 %-ного раствора серноватистокислого нат­рия и' 1 см³ 8 %-ного раствора хлористого железа. Среду разлива­ют в пробирки по 7 см³.

К 100 см³ мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.2.4 или п. 3.2.5, добавляют 1 г глюкозы, устанавливают pH 7,2, раз­ливают во флаконы по 100 см³ и стерилизуют 30 мин при темпера­туре 112°С. Перед употреблением к расплавленной и охлажден­ной до температуры 45°С среде прибавляют 20 см³ свежевзятой дефибринированной крови кролика. Среду разливают в чашки Петри.

К 1%-ной пептонной воде прибавляют 5—6 см³ обезжиренного молока, среду подвергают дробной стерилизации по 30 мин при Температуре 100°С трое суток подряд.

Обезжиренное молоко стерилизуют в течение 15—20 мин при температуре 112°С. Не допускается к применению стерилизован­ное молоко коричневого цвета и с карамелизованным сахаром.

Перед употреблением к 200 см³ стерилизованного молока добавляют примерно 1 см³ лакмусовой настойки до получения сиреневатого окрашивания и 1 см³ солянокислого цистеина до ко­нечной концентрации цистеина 0,08%.

Смесь асептически разливают по пробиркам высоким столби­ком, кипятят на водяной бане в течение 15—20 мин и охлаждают. Среду готовят перед проведением анализов.

Для приготовления солянокислого цистеина 1 г цистеина рас­творяют в 0,25 см³ 1 н. раствора соляной кислоты.

23

- - ■ I ■

Стр. 13 ГОСТ 20235.2—74

К 10 см³ этилового 96° спирта добавляют 1 г лакмуса и выдер­живают трое суток в термостате при температуре 37°С, ежесуточ­но сливая окрашенный спирт и заливая новой порцией этилового спирта, после чего лакмус подсушивают в термостате, заливают дистиллированной водой и выдерживают при комнатной темпера­туре в течение суток. Настойку фильтруют и хранят в темной склянке.

В 50 см³ этилового 96° спирта растворяют 4 г парадиметилами- добензолальдегида, затем медленно добавляют 50 см³ концентри­рованной соляной кислоты. Реактив хранят в склянке из темного •стекла при температуре 4—8°С.