Бактерии сальмонеллезной группы расщепляют глюкозу с образованием кислоты и газа, а маннит — с образованием кислоты. Вследствие образования кислоты меняется цвет среды.
Для определения индола и сероводорода посев производят в пептонную воду. Подозрительную на сальмонеллу колонию растирают в 0,5—1 л физиологического раствора. Полученную взвесь засеивают пастеровской пипеткой на указанную среду и помещают на 24 ч в термостат с температурой 37°С.
Для определения индола в пробирку с суточной культурой' осторожно по стенке добавляют 5—10 капель реактива Эрлиха.Стр. 19 ГОСТ 2023S.2—74
При наличии индола не позднее чем через 5 мин в пограничном слое образуется ярко-красное кольцо, при отсутствии — кольцо остается светло-желтого цвета. Сальмонеллы индола не образуют.
Для определения индолообразования пользуются также реактивом Ковача. К 24-часовой культуре добавляют 0,2—0,3 см3 реактива и взбалтывают. Результаты учитывают через 10 мин; реактив поднимается на поверхность среды и при наличии индола окрашивается в темно-красный цвет.
Для определения сероводорода в пробирку с анализируемой культурой под пробки помещают полоски фильтровальной бумаги, смоченные уксуснокислым свинцом и высушенные. Полоски фильтровальной бумаги не должны соприкасаться с питательной средой. Посевы выдерживают в термостате одни—трое суток при температуре 37°С. Если культура выделяет сероводород, то бумажка, смоченная раствором уксуснокислого свинца, чернеет от образующегося сернистого свинца. Сальмонеллы выделяют сероводород.
Для полной биохимической типизации бактерий сальмонелл проводят посев на расширенный пестрый ряд (табл. 1).
При наличии в препаратах палочек, характерных для сальмонелл и других грамотрицательных бактерий, культуру анализируют в реакции агглютинации на предметном стекле с поливалентной О-сывороткой.
Поливалентную агглютинирующую сыворотку применяют для дифференциаций культур рода Salmonella от других возбудителей кишечных инфекций, а монорецептурные О- и Н-сыворотки — для идентификации сальмонеллезных культур.
Предварительно культуры испытывают в реакции агглютинации на предметном стекле с поливалентной сывороткой.
Отрицательная реакция с поливалентной сывороткой означает, что испытуемая культура не принадлежит к роду Salmonella пяти основных групп (В, Сп Съ Дь Ei) и последующий анализ с О- и Н-агглютинирующими сыворотками не проводят.
Положительная агглютинация анализируемой культуры дает основание отнести ее к роду Salmonella одной из. пяти основных групп (В, Ci, Сг, Дь Ei). Такую культуру окончательно идентифицируют в реакций агглютинации с О- и Н-сыворотками, устанавливая в культуре наличие лишь основных, имеющих дифференциальное значение антигенов (табл. 2).
Идентификацию сальмонеллезных культур проводят в следующем порядке. Сначала культуру испытывают в реакции агглютинации с одной из О-сывороток, которую выбирают для кролика. При отрицательной реакции с первоначально взятой О-сывороткой культуру испытывают в реакции агглютинации с остальными четырьмя групповыми О-сыворотками и на основании положительной реакции агглютинации относят культуру к одной из групп.
за
|
Система NormaCS®Смете |
„Таблица 1 |
|||||||||||||||||||||||||||
|
1 ЕІШЛСІД j ма NormaCS® |
|
|||||||||||||||||||||||||||
|
Тил |
Лактоза |
Глюкоза |
1 Маннит |
Сахароза |
Мальтоза |
1 АдОННТ |
і Дульцит |
1 1 Арабиноза |
1 j Ксилоза |
1 1 Рамноза |
Мочевина |
Инозит |
Образование |
|||||||||||||||
|
иидола |
сероводорода |
|||||||||||||||||||||||||||
|
CQ Q (J t? Щ «II + + >X 31 www.normacs.ru 20.06.2007 |
<- |
—■— Е— .— |
||||||||||||||||||||||||||
|
Sal. abortus (eqi^n Sal. abortus ovis 7 Sal. typhi murium (Breslau) Sal. paratyphi В Sal. abortus bovis Sal. heidelberg Sal. cholerae sui$ Sal. cholerae suh v*r Kunzendorf Sal. newport Sal. bonariensis Sal. enteritidis Qartneri Sal. gallinarum Sal. pullorum Sal. anatum Sal. london овные обозначения; — отрицательный результ f-»— отрицательней Иног, положительный резуль —» — положительна^ рЄД1 рНЗЛИЧНЫе биОХ||эдцческ -ПОЗДНИЙ или нЄІІ0СТ9ЯНІ |
н і і і 1.1 і і і і і і і і |
+ + + + + 4~ + + + + юло ТИПІ XXQJ |
1 * g s а> + + + I+ + + ++++++I+ g s § * я - S |
4- 4, _|_ 4.. 4- 4- + 4-4- 3 н ж к S ~ |
її і і і і .і і і і і і і і і £ і |
4- 4» + 4- + “F 4" зультат ые; ли отр |
II 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 11 1 у , : — Ж |
CU £> 4" + + + X Х+>"++|++ •-Q |
* U jst . 1 [ **|** **]** *|* *|* |
-X- „ф. -«і* ***!"* |
! 4"* X £> 4" ”|* “h НН 1 —1——Р |
1 — ■■ - - |
V + + M*www |
II 1 1 1 1 1 11 1 1 +1 1 1 |
ГОСТ 20235.2—74 Стр. 20 1 +Х Х+++1 ++++++++ |
|||||||||||||
s
wСтр. 21 ГОСТ 20235.2—74
Т а б л и ц <1 2
|
Группы |
Тип |
О-антигены (соматические) |
Н-антигены (жгутиковые) |
|
|
I фазы |
II фазы |
|||
|
В |
Sal. abortus (equi) |
|
|
enx |
|
|
Sal. abortus ovis |
4 |
С |
1,6 |
|
|
Sal. typhi murium (Breslau) |
4,5 |
І |
1,2 |
|
|
Sal. paratyphi В |
4,5 |
b |
1,2 |
|
|
Sal. abortus bovis |
4 |
b |
enx |
|
|
Sal. heidelberg |
4,5 |
г |
1,2 -l |
|
Сд |
Sal. cholerae suis |
7 |
с |
1,5 |
|
|
Sal. cholerae suis |
7 |
|
1,5 |
|
|
Var. Kunzendorf |
|
|
|
|
<2 |
Sal. newport |
8 |
eh |
1,2 |
|
|
Sal. bonariensis |
8 |
і |
enx |
|
д. |
Sal, enteritidis Gartner (diblin) |
9 |
SP |
WMWM* |
|
|
Sal. gallinarum |
9 |
—— |
—— |
|
|
Sal. pullorum |
9 |
****** |
«— |
|
Ei |
Sal. anatum |
3,10 |
eh |
1,6 |
|
|
Sal. london |
3,10 |
Iv |
1,6 |
Культуру анализируют в реакции агглютинации с Н-сыворотками I и II фазы. В выборе сывороток для реакции исходят из антигенной структуры сальмонелл той группы, к которой отнесена -определенная культура с учетом животного, от которого она выделена.
На основании положительной реакции агглютинации с определенными О- и Н-сыворотками анализируемую культуру относят к одному из серотипов.
Для проведения реакции агглютинации на предметное стекло наносят каплю неразведенной поливалентной О-сыворотки. Платиновой петлей берут анализируемую 20-часовую культуру, выращенную на мясо-пептонном агаре, приготовленном по п. 3.2.4 или п. 3.2.5. Для агглютинации с поливалентной и О-сыворотками •с верхней части агара, а для агглютинации с Н-сыворотками — из нижней части пробирки вблизи конденсационной воды.
Культуру тщательно растирают на стекле у границы капли сыворотки с последующим смешиванием со всей каплей.
В положительных случаях О-агглютинация наступает медленно, а агглютинат имеет вид плотных с трудом разбиваемых комочков и зернышек. Н-агглютинация наступает быстрее и агглютинат имеет вид крупных рыхлых легко разбивающихся хлопьев.
32Агглютинат в реакции с поливалентной сывороткой имеет смешанный характер (хлопья, зернышки, комочки).
При отрицательной реакции культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки распределяется в ней в виде гомогенной взвеси.
Реакцию агглютинации проводят при хорошем освещении «с использованием лупы.
Обработка результатов
Обнаружение подвижных (кроме Sal. gallinarum, Sal. pullorum), грамотрицательных, не разлагающих лактозу и сахарозу, разлагающих глюкозу и маннит, выделяющих сероводород, не образующих индола, обладающих положительной агглютинацией с поливалентной монорецепторным О- и Н-агглютинирующими сыворотками бактерий указывает на бактерии рода Salmonella.
Определение бактерий рода Эшерихи
Сущность метода заключается в способности бактерий рода Эшерихи на средах с лактозой (Эндо, Левина, Плоскирева) , разлагать лактозу с образованием кислоты, вызывающей окрашивание колоний в зависимости от индикатора среды и дальнейшей дифференциации бактерий по их биохимическим свойствам от других сходных микроорганизмов. Но есть отдельные бактерии рода Эшерихи, которые обладают способностью разлагать лактозу, вследствие чего цвет среды не меняется.
На среде Эндо колонии бактерий рода Эшерихи могут быть ‘Красными с металлическим блеском или без блеска, розовыми с красным центром или белыми; на среде Плоскирева — кирпичнокрасными с глянцевой поверхностью; на среде Левина — темно- -фиолетов ым и блестящим и.
Проведение анализа
Из колоний, характерных для бактерий рода Эшерихи, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Бактерии рода Эшерихи — маленькие палочки с закругленными концами, по Граму окрашиваются отрицательно.
Для определения подвижности культуры и ее сохранения проводят посев в столбик 0,5%-ного полужидкого агара.
Для более четкого проявления особенности роста прокол среды делают у стенки пробирки и помещают на 24 ч в термостат с температурой 37°С.
Бактерии рода Эшерихи обладают активной подвижностью, зследствие чего в столбике полужидкого агара отмечается выраженное равномерное помутнение полужидкого агара.
Неподвижные формы микробов растут только по ходу прокола
!реДЫ.
33Стр. 23 ГОСТ 20235.2—74
При наличии колоний, характерных для бактерий рода Эшери- хи, их дифференцируют от других микроорганизмов EuterobactoT riaceae по биохимическим свойствам, указанным в табл. 3.
Таблица &
Т
РИБЫ
Дифференцирующие тесты
Образование сероводорода Расщепление мочевины Образование индола Реакция с метилротом Реакция по Фогес-Проскауэра Использование цитратов Дезаминирование фенилаланина
Условные обозначения:
«+» —положительная реакция;
«—>—отрицательная реакция;
реакция положительная, реже отрицательная; «±> — положительная реакция, может быть отрицательной.
Для определения сероводорода анализируемую культуру засевают уколом в столбик среды Кристенсена и помещают на 24—48 ч в термостат с температурой 37°С.
Бактерии рода Эшерихи сероводорода не образуют и среда не меняет цвет.
Микроорганизмы, образующие сероводород, окрашивают среду в черный цвет.
Для установления способности бактерий рода Эшерихи расщеплять мочевину, производят посев культуры в среду с мочевиной (среда Христенсена) и выдерживают 24 ч в термостате при температуре 37°С. Бактерии рода Эшерихи не расщепляют мочевину и цвет среды не меняется. При наличии бактерий, расщепляющих мочевину, реакция среды становится резко щелочной и среда приобретает малиновый цвет.
Индол определяют с реактивом Ковача по п. 3.2.35. Бактерии рода Эшерихи чаще образуют индол.
Для определения интенсивности кислотообразования и способности рода Эшерихи продуцировать ацетилметилкарбинол (реак* ция Фогес-Проскауэра) проводят посев анализируемой культуры в две пробирки со средой, приготовленной по п. 3.2.19, и помеща-г 34
ГОСТ Стр. 24
«от на 24—96 ч в термостат с температурой 37°С. Затем в одну пробирку прибавляют пять-шесть капель раствора метиленового красного.
При сильном кислотообразовании среда становится ярко-красной, при слабом — красно-оранжевой. При отрицательной реакции среда становится желтой.
Бактерии рода Эшерихи разлагают глюкозу с образованием кислоты.
Для определения ацетилметилкарбинола ставят реакцию Фо- гес-Проскауэра. К трех-, четырехсуточной культуре прибавляют Ю,5 см3 реактива Фогес-Проскауэра и на кончике скальпеля креатин. Содержимое пробирки взбалтывают и выдерживают 4 ч при температуре 18—24°С.
В результате образования ацетилметилкарбинола на глюкозе цвет среды из слабо-розового переходит в красный; отсутствие изменений в цвете среды рассматривают как отрицательный результат. Бактерии рода Эшерихи не образуют ацетилметилкарбинола.
Для определения способности бактерий рода Эшерихи использовать цитраты культуру засевают на скошенный агар Симмонса, посевы выдерживают 24 ч в термостате с температурой 37°С.
Кишечная палочка не растет на среде и не меняет ее цвета, а цитратассимиллирующие микробы растут хорошо, подщелачивают среду, тем самым вызывая ее окрашивание в синий цвет.
