В 75 см3 амилового спирта растворяют 5 г парадиметиламидо- ’бензолальдегида, затем медленно добавляют 25 см3 концентрированной соляной кислоты. Реактив хранят в склянке из темного стекла при температуре 4—8°С.
Приготовление реактива для определения сероводорода
В 100 см3 дистиллированной воды растворяют 20 г уксуснокислого свинца и 1 г двууглекислой соды. В этом растворе пропитывают полоски фильтровальной бумаги (1X2 см) и высушивают их при температуре 18—23°С.
Приготовление реактива для реакции с метилротом
В 300 см3 этилового спирта растворяют ОД г метилового красного, затем смешивают с 500 см3 дистиллированной воды.
Приготовление реактива для реакции Фогес-Проскауэра
В 500 см3 дистиллированной воды растворяют 200 г гидрата окиси калия. Креатин добавляют на кончике скальпеля в одну пробирку перед употреблением. Креатин хранят в сухом месте.
Приготовление насыщенного спиртового раствора мети- леновой сини
В 100 см3 этилового 96° спирта растворяют 8—9 г метиленовой сини. Раствор фильтруют.
Приготовление спирто-водного раствора метиленовой €UHU
К 30 см3 дистиллированной воды добавляют 1 см3 насыщенного спиртового раствора.
Приготовление метиленовой сини (Леффлера)
К ЮО см3 дистиллированной воды добавляют 20 см3 насыщенного спиртового раствора метиленовой сини и 1 см3 1 %-ного спиртового раствора гидрата окиси калия:
Приготовление фуксин-насыщенного спиртового раствора 8—9 г основного фуксина высыпают во флакон, заливают 100 см3 этилового 96° спирта и ставят на 18—24 ч в термостат 24с температурой 37°С. Флаконы периодически взбалтывают. В течение указанного времени значительная часть краски растворяется и на дне флакона остается осадок, свидетельствующий о насыщении раствора.
Насыщенный раствор хранят во флаконах из темного стекла.
Из насыщенного спиртового раствора готовят фуксин-спирто- водный раствор. Для этого к 1 см3 насыщенного раствора прибавляют 9 см3 дистиллированной воды.
Приготовление фуксина Циля-Карболового
г основного кристаллического фуксина. Циля растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 см® гли- церина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см3 этилового 96° спирта. После того, как краска полностью разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 см3 дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют. Фуксин Циля стойкий и его хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.
Перед работой к одной части карболового фуксина Циля прибавляют девять частей дистиллированной воды.
Приготовление кристаллвиолета и генциан фиолетового для окраски по Граму
В 100 см3 этилового 96° спирта растворяют J г кристаллвиолета и 1 см3 глицерина. *
Краску наливают в лоток. Фильтровальную бумагу нарезают полосками шириной 2,0—2,5 см и длиной 30—50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краску так, чтобы она окрасилась с обеих сторон. Окрашенные полоски вынимают пинцетом, дают краске стечь и подвешивают на шпагате для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при температуре 18—23°С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2X2 см и хранят в банке из темного стекла.
Приготовление раствора Люголя
В 10 см3 дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают несколько часов до полного растворения йода, после чего прибавляют 290 см3 дистиллированной воды.
Приготовление препаратов
Поверхность паренхиматозных органов тазобедренных мышц и пораженных участков мяса кролика стерилизуют, прикладывая раскаленный шпатель или обжигая тампоном, смоченным в спирте. Затем вырезают стерильными ножницами кусочки размером 1,5ХЬ0ХЬ5 или 2,0ХЬ5Х2,5 см и прикладывают поверхностями срезов к предметному стеклу по три отпечатка на двух предметных стеклах. Препараты высушивают на воздухе, фиксируют, скрашивают по Граму, Романовскому—Гимза и метиленовой синь-Стр. 15 ГОСТ 2023S.2—74
кой (в зависимости от характера патологических изменений и предполагаемого диагноза). Мазки микроскопируют.
Приготовление мазков из культуры
Метод раздавленной капли
На середину предметного стекла наносят петлей для бактериологических испытаний или пипеткой каплю анализируемой культуры, осторожно покрывают ее покровным стеклом, чтобы под. ним не образовалось пузырьков воздуха и жидкость не выступала за края покровного стекла.
Для приготовления мазков требуются чистые обезжиренные предметные стекла (капли воды на поверхности чистого- сухого стекла должны расплываться, а не принимать шаровидную форму). Чтобы приготовить мазок из культуры с плотной средой,, на предметное стекло наносят, небольшую каплю стерильного физиологического раствора или водопроводной воды, затем при соблюдении асептики открывают пробирку или чашку Петри и. захватив немного материала прокаленной и остуженной бактериологической петлей, размешивают его в этой капле. Полученную взвесь растирают на площади 1 см2. Материал из жидкой среды берут пипеткой или бактериологической петлей и готовят препарат аналогичным образом непсредственно на стекле.
Приготовленный препарат высушивают на воздухе. Если высушиваемые препараты содержат патогенный материал, их накрывают стеклянным колпаком. После приготовления мазка петлю прожигают на пламени горелки, а пипетку опускают в сосуд с де— зинфицирующим раствором. Для фиксации мазок трижды медленно проводят через пламя спиртовой или газовой горелки. При излишнем нагревании сильно изменяется структура клеток » мазок плохо окрашивается, при недостаточной фиксации, мазок можно смыть при последующей обработке. Фиксацию можно проводить, погружая мазки в фиксирующие жидкости — на 5 мин в метиловый спирт, на 15—20 мин в этиловый 96° спирт, на 5 мин в ацетон, на 10—15 мин в смесь равных объемов абсолютного- спирта и эфира по Никифорову. После фиксации препарат высушивают на воздухе.
Окраска препаратов
Окраска мазков по Граму
При окраске по Граму на фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают карболовый генциан фиолетового на 2 мин, после чего снимают бумажку, сливают краску и, промывая водой, наливают на мазок раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1 мин его сливают и наливают этиловый спирт на 0,5—1 мин, причем препарат нужно покачивать и менять спирт. 26
ГОСТ 20135.2—74 Стр. 16
Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течение 1—2 мин. Краску сливают, промывают водой, обсушивают фильтровальной бумагой.
Окраску по Граму можно применять в видоизменении Синева, согласно которому вместо карболового генциан фиолетового применяют раствор следующего состава: 1 г кристаллвиолета, 100 см3 этилового 96° спирта, 1 см3 глицерина (необязательно). Кристаллвиолет можно заменить равным количеством метиллвиолета или генциан фиолетового.
Для окрашивания мазков на фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором кристаллвиолета, и наносят несколько капель воды, которая полностью впитывается бумагой, последняя плотно прилегает к стеклу. Выдерживают 2 мин, затем бумажку удаляют пинцетом и дальнейшую окраску производят по Граму.
Окраска спор
Мазок, приготовленный по п. 3.3.2, окрашивают при нагревании 1—2 мин карболовым фуксином Циля, до появления паров, промывают водой и обесцвечивают погружением в 2%-ный раствор азотной кислоты в спирте или 1%-ный водный раствор серной кислоты.
Обесцвечивать нужно так, чтобы на препарате не было видно следов красителя. Затем промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего. Споры окрашиваются в красный цвет.
Окраска капсул методом Михина
Фиксированный мазок окрашивают в течение 2—3 мин синькой Леффлера при подогревании (до появления паров), после чего краску быстро смывают водой и мазок высушивают между листками фильтровальной бумаги. Бактерии окрашиваются в тем- но-синий цвет, капсулы — в светло-розовый.
Окраска капсул методом Романовского-Гимза
Краску Романовского-Гимза фабричного изготовления перед окрашиванием мазков растворяют из расчета одна капля краски на 1 смэ дистиллированной воды. Разведенную краску наливают в чашку Петри, на дно которой кладут две тонкие стеклянные палочки или спички. Мазок, предварительно зафиксированный метиловым спиртом, после высушивания кладут намазанной поверхностью вниз и наливают краску до соприкосновения с мазком* Мазки окрашивают в течение 30—40 мин, затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе в вертикальном положении. Микробы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, капсулы — в красно-фиолетовый.
Стр. 17 ГОСТ 20235.2—74
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Определение аэробов
Наряду с бактериоскопией мазков-отпечатков проводят посев паренхиматозных органов, пораженных мышц кусочками, размером 1,5X1,0X1,5 или 2,0X1,5X2,5 см путем контакта их. с поверхностью элективных сред (Эндо, Плоскирева, Левина, висмут-сульфитный агар), а на мясо-пептонный агар путем посева взвеси материала на его поверхность. Для приготовления взвеси из глубины пораженных мышц и органов берут пробу массой 1—3 г, тщательно растирают в ступке с небольшим количеством стерильного песка, добавляют стерильный физиологический раствор или стерильную воду для разведения материала 1 : 10. Затем стерильной пипеткой берут 0,2—1 см3 взвеси и переносят на поверхность мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.2.4. Внесенный материал стерильным шпателем равномерно распределяют по всей поверхности среды. Чашки с посевами помещают в термостат и выдерживают 16—24 ч при температуре 37°С, а посевы на висмут-сульфитном агаре — 48 ч. Посевы просматривают невооруженным глазом или под микроскопом с увеличением в 8—10 раз.
Одновременно с посевами на твердые среды проводят посевы материала на среды обогащения. Анализ проводят по следующей методике. При соблюдении асептики из образца вырезают пробы массой по 25 г (две из мышц и две из паренхиматозных органов), помещают их отдельно в стерильные ступки. Пробы хорошо измельчают и вносят в 225 см3 одной из сред: Мюллера, Кауфмана, селенитового бульона, хлористомагниевой. Посевы выдерживают 16—24 ч при температуре 37°С. Затем из сред обогащения проводят посев на элективные среды и помещают на 16— 48 ч в термостат с температурой 37°С.
В зависимости от результатов бактериоскопии и характера роста на твердых питательных средах в дальнейшем проводят анализ проб из образцов на основании определенных при этом отдельных видов микробов.
Определение сальмонелл
Сущность метода заключается в определении сальмонелл на элективных средах и установлении биохимических и серологических свойств сальмонелл.
Биохимические свойства сальмонелл определяют на средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты. Под действием ферментов, выделяемых микробами, одни среды остаются неизменными и их цвет не меняется, в то время как другие углеводы и многоатомные спирты расщепляются, образуя кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора и соответственно цвет среды. 28Некоторые сальмонеллы продуцируют и выделяют протеолитические ферменты, которые расщепляют белки до продуктов глубо* кого распада — индола и сероводорода.
Серологические свойства определяют в реакции агглютинации с агглютинирующими сыворотками. Поливалентную агглютинирующую сыворотку применяют для дифференциации культур рода Salmonella от других возбудителей кишечных инфекций.
На средах с лактозой (Эндо, Левина, Плоскирева) колонии сальмонелл бесцветные, на висмут-сульфитном агаре — черные с металлическим блеском, на месте снятой колонии остается черный след. Черное окрашивание среды зависит от восстановления солей бактериями.
Проведение анализа
Если наблюдается обильный рост однородных колоний (чистая культура), то эту культуру используют для анализа. В случае сомнений в чистоте культуры проводят ее пересев на скошенный мясо-пептонный агар. Посевы помещают на 24 ч в термостат с температурой 37°С.
При обнаружении характерных колоний на сальмонеллы из небольшой части колонии делают мазок, окрашивают по Граму и определяют подвижность в раздавленной капле. Бактерии сальмонелл представляют собой неспорообразующие маленькие палочки с закругленными концами, по Граму окрашиваются отрицательно. Бактерии из рода сальмонелл подвижны, но из них галлина- рум и пуллорум неподвижны.
Для изучения биохимических свойств проводят посев на короткий пестрый ряд, состоящий из сред Гисса с лактозой, глюкозой, сахарозой и маннитом.
Часть подозрительной колонии снимают бактериологической петлей и размешивают в 0,5—1 см3 физиологического раствора. Полученную взвесь засевают пастеровской пипеткой на указанные среды и помещают на 12—16 ч в термостат с температурой 37°С, после чего посевы просматривают и учитывают ферментативные свойства микробов. Бактерии сальмонеллезной группы не разлагают лактозу и сахарозу, не меняют окраску среды.
