Страница 5: ГОСТ 20235.2-74. Мясо кроликов. Методы бактериологического анализа (73560)

Для определения способности бактерий дезаминировать фенил­аланин производят обильный посев культуры в пробирки со ско­шенным фениналаниновым агаром и выдерживают 4—24 ч в тер­мостате с температурой 37°С, после чего на косяки с культурой добавляют по четыре-пять капель 0,5 см³ раствора хлорида окиси железа. При дезаминировании фенилаланина среда окрашивается в зеленый цвет. Бактерии рода Эшерихи не дезаминируют фенил­аланин и цвет среды не меняется.

Обнаружение подвижных грамотрицательных палочек, дающих сильное кислотообразование, образующих индол, не расщепляю­щих мочевину, не дезаминирующих фенилаланин, не использую­щих цитраты, не образующих сероводород и ацетилметилкарбенол указывает на бактерии рода Эшерихи.

4Д.5. Определение бактерий листерий и пастерелл

3

5vrp. IUI.I —74

Для проведения анализа из пораженных мышц готовят препа­раты-отпечатки по п. 3.3.1, окрашивают по Граму и Романовско­му-Гимза и микроскопируют.

Одновременно производят посев с анализируемых мышц на мясо-пептонный агар, приготовленный по п. 3.2.4, и на мясо-пеп­тонный бульон с добавлением к нему 2 г глюкозы. Посевы выдер­живают в течение 24 ч в термостате при температуре 37°С, после чего производят учет роста колоний.

Из колоний, характерных для листерий и пастерелл, готовят мазки, окрашивают их по Граму, Ром айовскому-Гимза и микро­скопируют. Характеристика возбудителей по культурально-морфо­логическим свойствам приведена в табл. 4.

Таблица 4

Для получения чистой культуры производят посев на скошен­ный мясо-пептонный агар. Посевы выдерживают в течение 24 ч в термостате при температуре 37°С, после чего проверяют куль­туру на чистоту путем микроскопии.

36Для определения образования индола и сероводорода произво­дят посев на пептонную воду, а для определения биохимических свойств производят посев на желатин и молоко.

Сероводород и индол определяют по п. 4.1.3.2.

Для определения каталазной пробы в пробирку с культурой на мясо-пептонном бульоне, выдержанной в течение 12—24 ч в тер­мостате при температуре 37°С, добавляют 1 см⁵ 10 %-ного раствора перекиси водорода.

При наличии каталазы жидкость вспенивается.

Для того, чтобы выделить бактерии листерий производят глаз­ную пробу: в конъюнктивальный мешок морской свинки вводят одну-две капли смыва физиологическим раствором суточной куль­туры с мясо-пептонного агара и тщательно втирают в слизистую оболочку глаза морской свинки. Через 24 ч появляется отек века, гиперимия, слезотечение, через 36—72 ч веки опухают и из глаза выделяется гнойный эксудат.

Материалом для подкожного заражения лабораторных живот­ных (кроликов, белых мышей) является 0,2—0,5 см³ чистой куль­туры возбудителя, животные обычно погибают через 24—48 ч.

Дифференциация листерий и пастерелл по биохимическим свойствам представлена в табл. 5.

Таблица S

Пастереллы

Листерии

Наименование показателей

Разжижение желатина Свертывание молока Образование сероводорода Образование индола Реакция на каталазу Действие на морских свинок

Условные обозначения:

«+»— положительный результат;

<—> — отрицательный результат;

<О» — анализы не проводятся.

Обнаружение в препаратах-отпечатках мелких палочек, распо­ложенных одиночно в виде римской цифры пять или в виде часто­кола, грамположительных подвижных, а в мазках из культуры— коротких овоидных палочек, не образующих сероводород и при заражении ими морских свинок в конъюнктивидный мешочек гла­за вызывающих опухоль глаза и выделение гнойного эксудата указывает на возбудителя листериоза.

37 Система NormaCS® www.normacs.ru 20.06.2007Стр. 27 ГОСТ 20235.2—74

Обнаружение в препаратах-отпечатках коротких палочек с закругленными концами и хорошо выраженной биополярностью, а в мазках из культуры — неспорообразующих палочек, грамотри- цательных, неподвижных и не имеющих биополярности, гибель ла­бораторных животных через 24—48 ч после заражения культура­ми указывает на возбудителя пастереллеза.

Для проведения анализа из пораженных мышц готовят препа­раты, производят посев на мясо-пептонный агар по п. 4.1.1.

Из колоний, характерных для стафилококков, готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Стафилококки по Граму окрашиваются положительно, имеют шарообразную форму, располагаются группами различной величины, напоминающие гроздья винограда, иногда поодиночке. После микроскопирования делают пересев на скошенный мясо-пептонный агар и помещают на 18—24 ч в термостат с температурой 37°С, после чего культуру определяют на патогенность в реакции плазмокоагуляции. Плаз­му крови кролика, приготовленную по п. 3.2.24, разливают в две стерильные пробирки, в одну из них вносят петлю стафилококко­вой культуры, другая пробирка служит для контроля. Внесенную культуру тщательно размешивают, после чего обе пробирки выдерживают 2—10 ч в термостате при температуре 37°С. Если в указанное время коагуляции не произошло, то пробирки остав­ляют на 18 ч при комнатной температуре. Если через 18 ч плазма не свернулась, то анализируемую культуру стафилококков относят к коагулазоотрицательной.

При получении положительной реакции плазмокоагуляции счи­тают, что в посевах обнаружен патогенный стафилококк.

Для определения дезоксирибонуклеазной активности стафило­кокков производят посев на среду, приготовленную по п. 3.2.26, и выдерживают 18—20 ч в термостате при температуре 37°С, после чего прибавляют 5 см³ 1 н. раствора соляной кислоты. Через 2 — 3 мин ее сливают, а через 7—10 мин определяют результат реак­ции.

Положительной реакцией считают образование прозрачной зо­ны вокруг колонии, содержащей продукты расщепления ДНК, ко­торые не осаждаются соляной кислотой.

■ Обнаружение грампложительных, расположенных гроздями или поодиночке кокков, способных коагулировать плазму крови 38кролика и выделять ДНК-азу указывает на патогенные стафило­кокки.

Для проведения анализа производят посев на мясо-пептонный агар, приготовленный по п. 3.2.4. На мясо-пептонном агаре стреп­тококки образуют мелкие круглые плоские прозрачные, а затем мутнеющие колонии. Из колоний делают мазки и окрашивают по Граму. Стрептококки располагаются в мазках цепочкой длиной всего 2—3 кокка, иногда 5—8 кокков, окрашиваются положитель­но. Для получения чистой культуры делают пересев на сахарный бульон. Посевы помещают на 24 ч в термостат с температурой 37°С.

Стрептококки на бульоне дают придонный рост, бульон остает­ся прозрачным.

Через 24 ч производят пересев культуры с бульона на чашки Петри с кровяным агаром, приготовленным по п. 3.2.27. Посевы выдерживают 18—24 ч в термостате при температуре 37°С.

По характеру роста на кровяном агаре стрептококки делятся на гемолитические, дающие вокруг колоний зону гемолиза; зеле- няющие, образующие колонии зеленого цвета без резкого гемолиза; не изменяющие кровяного агара.

Обнаружение грамположительных расположенных цепочками кокков, вызывающих гемолиз на кровяном агаре, указывает на патогенные стрептококки в мясе кролика.

4.2. Определение анаэробов

На среде Вильсон-Блера отмечается сильное газообразование и помутнение среды за счет восстановления сернистокислого нат-. рия в сульфат натрия, который взаимодействует с хлористым железом и образует черный осадок сернистого железа.

Для определения Cl. perfringens готовят препараты-отпечатки по п. 3.3.1, окрашивают по Граму и метиленовым синим и микро- скопируют.

В препаратах обнаруживают короткие толстые палочки с за­кругленными концами, грамположительные. При окраске метиле-

39Стр. 29 ГОСТ 20235.2—74

новым синим обнаруживают наличие капсул. Одновременно из ма­териала готовят взвесь по п. 4.1.1 и производят посев в две про­бирки со средой Китт-Тароцци. Полученную взвесь в количестве 2—3 см³ вносят в каждую пробирку. Перед посевом среду прогре­вают на водяной бане 20 мин при температуре 80°С для удаления кислорода. Одну из засеянных пробирок также прогревают на водяной бане для уничтожения аэробной микрофлоры. Посевы помещают на пять суток в термостат с температурой 37°С. За по­явлением роста микроорганизмов наблюдают ежедневно. Развитие Cl. perfringens в среде начинается с появлением равномерной мути по всей толще столбика, отступая от его поверхности на 0,5— 1,0 см. Прорастание спор и деление клеток сопровождаются выде­лением газа. Среда при развитии в ней Cl. perfringens дает сырный запах. Муть в среде постепенно исчезает, культура остается на дне в виде небольшого осадка. В мазках из 18-, 24-часовой культуры наблюдаются грамположительные палочки. В мазках, приготов­ленных из осадка, наблюдаются толстые палочки с закругленны­ми концами, со спорами, расположенными группами параллельно друг к другу по две, одиночно или цепочкой.

Подвижность клеток определяют микроскопированием в раз- давленнои капле. Клетки Cl. perfimgens неподвижны.

При обнаружении в среде Китт-Тароцци характерных для Cl. perfringens палочек производят посев в лакмусовое молоко с цистеином, среду Вильсон-Блера и на кровяной агар. Посевы помещают на 18—24 ч в термостат с температурой 47°С.

Посев на среду Вильсон-Блера производят следующим обра­зом. Среду расплавляют и охлаждают до температуры 45°С. По­сев производят пастеровской пипеткой вглубь так, чтобы не по­пали пузырьки воздуха.

Посевы на чашках Петри с глюкозо-кровяным агаром (по Цейсслеру) выдерживают в анаэростате при температуре 37°С.

При отсутствии анаэростатов можно использовать чашечный метод или метод Виньяля-Вейона.

При использовании чашечного метода в среду, приготовленную по Цейсслеру, вносят 0,25—0,5 см³ анализируемой взвеси. Среду осторожно взбалтывают без образования пены и наливают в крышку стерильной чашки Петри, после чего на почти застывший агар помещают вторую половину чашки Петри так, чтобы дно плотно соприкасалось с поверхностью залитого агара. Края чашки заливают парафином или замазывают пластилином* Чашки поме­щают на 18—24 ч в термостат с температурой 37°С. Выросшие колонии рассматривают с помощью лупы.

При использовании метода Виньяля-Вейона засеянный мате­риал набирают в стеклянную трубку (пастеровские пипетки дли­ной 20 см и диаметром 0,75 см), один конец которой закрыт ватой, 40а другой оттянут. Среду набирают не более чем на ³4 длины Труб­ки, после чего оттянутый конец трубки запаивают. Трубки со сре­дой помещают в термостат с температурой 37°С. На вторые—пятые сутки посевы в трубках просматривают и отмечают рост отдель­ных колоний. При наличии газа столбик агара разрывается.

По истечении срока термостатирования учитывают результат роста:

в пробирках с лакмусовым молоком Cl. perfringens бурно фер­ментирует молоко с образованием губчатого сгустка красновато­сиреневого цвета в верхней части пробирки, при этом сыворотка становится прозрачной;

на среде Вильсон-Блера через 18 ч отмечается образование в глубине агара черных колоний, разрывающих среду вследствие газообразования;

на кровяном агаре образуются круглые; влажные серовато­оливковые или зеленые с зоной гемолиза колонии.

Обнаружение неподвижных грамположительных палочек, вызы­вающих бурную ферментацию молока с образованием губчатого сгустка красновато-сиреневого цвета, черных колоний на среде Вильсон-Блера, серовато-оливковых или зеленых колоний с зо­ной гемолиза указывает на Cl. perfringens в мясе кролика.