ГОСТ 17.1.4.02-90. Вода. Методика спектрофотометрического определения хлорофилла - а (68860)

ГОСТ 17.1.4.02-90

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ВОДА

МЕТОДИКА СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ХЛОРОФИЛЛА а

Издание официальное

БЗ 3-99

ИПК ИЗДАТЕЛЬСТВО СТАНДАРТОВ
МоскваИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Институтом океанологии АН СССР, соисполнитель — Гидрохимический институт Госкомгидромета СССР

РАЗРАБОТЧИКИ

М.Е. Виноградов, член-корр. АН СССР; Б.В. Коновалов, канд. биол. наук (руководители темы); В.А. Кимстач, д-р хим. наук; А.А. Назарова, канд. хим. наук; Т.О. Гончарова, канд. хим. наук

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по охране природы от 03.07.90 № 28

3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

5. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Июль 1999 г.

Редактор М.И. Максимова
Технический редактор О.Н. Власова
Корректор С.И. Фирсова
Компьютерная верстка Л.А. Круговой

Изд. лиц. № 021007 от 10.08.95. Сдано в набор 03.08.99. Подписано в печать 09.09.99. Усл. печ. л. 1,40. Уч.-изд. л. 1,07.

Тираж 127 экз. С3628. Зак. 752.

ИПК Издательство стандартов, 107076, Москва, Колодезный пер., 14.

Набрано в Издательстве на ПЭВМ

Филиал ИПК Издательство стандартов — тип. “Московский печатник”, Москва, Лялин пер., 6.
Плр № 080102

МЕЖГОСУД АРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

В

ГОСТ
17.1.4.02-90

Water. Spectrophotometric determination
of chlorophyll a

ОКСТУ 2209

Дата введения 01.01.91

ВВЕДЕНИЕ

Хлорофилл а — основной пигмент зеленых растений, в том числе одноклеточных водорослей (фитопланктона). Из нескольких десятков пигментов, содержащихся в фотосинтетическом аппарате водорослей, хлорофиллу а отведена важнейшая роль в процессе фотосинтеза. Информация о концентрации хлорофилла а и ее изменчивости в водном объекте служит критерием при оценке запасов биомассы фитопланктона и его продукции, а также индикатором загрязнения вод. Соотно­шение между концентрацией хлорофилла а и продуктами его превращений, а также другими пигментами (хлорофилл Ь, хлорофилл с^+с₂, каротиноиды) характеризуют физиологическое состо­яние водорослей.

1. НАЗНАЧЕНИЕ И ОБЛАСТЬ РАСПРОСТРАНЕНИЯ

   1. Методика регламентирует определение содержания хлорофилла а фитопланктона в пробах вод морских и поверхностных суши. Допускается использовать данную методику для определения хлорофилла а микрофитобентоса и микрофлоры льда. Результаты определений по данному стандарту могут быть использованы для калибровки непрямых методов оценки содержания хлорофилла а, в том числе при космическом зондировании состояния водных объектов, а также при регистрации роста водорослей в биохимических экспериментах.

   2. Методика предназначена для органов государственного контроля за состоянием водных объектов, ведомственных научно-исследовательских экологических и промысловых работ.

   3. Диапазон определяемых концентраций хлорофилла а, для которого устанавливаются пределы допускаемой погрешности определений, выполняемых по данной методике, составляет от 0,05 мг м^-3 до любых максимальных значений, встречающихся в природных водах.

   4. Основными компонентами, мешающими анализу, являются хлорофилл Ь, хлорофилл cj+c₂, феофитин а, феофорбид а и хлорофиллид а. Содержание хлорофилла Ь, хлорофилла Cq+сэ, суммарное содержание феофитина а и феофорбида а соизмеримо с содержанием хлорофилла а, поэтому поправка на присутствие этих пигментов вносится при расчете концентрации хлорофилла а. Содержание хлорофиллида а обычно несоизмеримо мало по сравнению с содержанием хлорофил­ла а, поэтому поправка на его присутствие не вносится.

   5. Определяемое вещество — хлорофилл а — легко разрушается под воздействием света, при повышении температуры и в кислой среде, поэтому при проведении любых процедур, начиная с момента отбора пробы и до окончания спектрофотометрирования следует обеспечить нахождение объекта анализа (пробы, фильтра с осадком или экстракта) в затемненном прохладном месте при отсутствии паров кислоты.

   6. Продолжительность анализа одной пробы от момента ее отбора до окончания спектрофо­тометрирования без учета времени хранения пробы, фильтра с осадком и экстракта не должна превышать 3 ч.

П

Издание официальное

2. © Издательство стандартов, 1990 © ИПК Издательство стандартов, 1999ССЫЛКИ НА СТАНДАРТЫ, СОВМЕСТНО С КОТОРЫМИ
   ДОЛЖЕН ПРИМЕНЯТЬСЯ НАСТОЯЩИЙ СТАНДАРТ

ГОСТ 17.1.5.04 Охрана природы. Гидросфера. Приборы и устройства для отбора, первичной обработки и хранения проб природных вод. Общие технические условия.

ИСО 5667-2 Качество воды. Отбор проб. Часть 2. Руководство по технике отбора проб.

3. СУЩНОСТЬ МЕТОДА

В основе метода — спектрофотометрирование экстракта пигментов до и после его подкисления раствором соляной кислоты. Расчеты концентрации хлорофилла а основаны на известных удельных спектральных показателях поглощения света хлорофиллом а и основными компонентами, мешаю­щими анализу.

Для приготовления экстракта пробу воды фильтруют через мембранный фильтр с нанесенным на нем слоем углекислого бария или магния, осадок размельчают (гомогенизируют), пигменты экстрагируют водным ацетоном из гомогената и удаляют центрофугированием из экстракта свето­рассеивающую взвесь.

4. РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ

   1. Силикагель по ГОСТ 3956.

   2. Ацетон ч.д.а. по ГОСТ 2603.

   3. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

   4. Кислота соляная х.ч. по ГОСТ 3118.

   5. Барий углекислый ч.д.а. по ГОСТ 4158.

   6. Магний углекислый основной ч.д.а. по ГОСТ 6419.

   7. Бумага фильтровальная — по нормативно-технической документации (НТД).

   8. Фильтры мембранные размерами пор 0,6—0,9 мкм: отечественного производства «Влади- пор» типа МФА-МА №№ 6—9 (0,6—0,9 мкм) (см. приложение 1, п. 2) или типа МФЦ № 4 (0,6 мкм) по НТД; производства зарубежных фирм Synpor № 4 (0,85 мкм) или № 5 (0,6 мкм), Millipore НА, Whatman GF/F.

5. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ И ОБОРУДОВАНИЕ

   1. Спектрофотометр. Выделяемый спектральный интервал должен быть не более 2—3 нм, точность установки длин волн в диапазоне 430—750 нм не ниже ±2 нм, погрешность измерений по шкале оптических плотностей не более 0,01Б. Например спектрофотометры: двухлучевой типа СФ-18 или однолучевой типа СФ-46 по НТД.

   2. Центрифуга лабораторная. Вместимость пробирок 10 см³, число гнезд 6(12), ускорение 4000—5000 g. Например типа ЦЛН-2 или ОПн-ВУХЛ 4.2 по НТД.

   3. Установка фильтровальная с воронками под фильтры мембранные диаметром от 35 до 142 мм (см. приложения 3 и 4).

   4. Гомогенизатор механический с вместимостью 10—15 см³. Ступка фарфоровая № 1—3 (диаметр 50—90 мм) с пестиком № 2 (диаметр 22—34 мм) по ГОСТ 9147. Рекомендуется также устройство из стекла, схема которого дана в приложении 5.

   5. Насос вакуумный, типа НВР-1 или ЗНВР-1Д, или отсасыватель хирургический ОХ-10 по НТД.

   6. Батометр (см. приложение 1, п. 1).

   7. Канистры полиэтиленовые черного цвета вместимостью 3, 5, 10 и 20 дм³.

   8. Ведро полиэтиленовое или эмалированное.

   9. Эксикатор диаметром 140, 190 или 250 мм по ГОСТ 25336.

   10. Пробирки стеклянные градуированные с притертой пробкой на 10 см³ с ценой деления 0,1 см³ по ГОСТ 1770 и НТД.

6. ПОДГОТОВКА РЕАКТИВОВ И ФИЛЬТРОВ

   1. Порошок углекислого бария (ВаСОз) тщательно растирают в фарфоровой ступке с добавлением небольшого количества дистиллированной воды или фильтрованной природной. Из полученной массы удаляют самую грубую фракцию, оседающую со скоростью более 0,5 см с^--1, после чего эту массу используют для приготовления суспензии. Рекомендуемая концентрация ВаСО₃ в суспензии 30 г-дм^-3. Порция суспензии, добавляемой в фильтровальную воронку перед фильтро­ванием, берется из расчета 20 мг ВаСО₃ на 1 см² поверхности фильтра.

   2. Мембранные фильтры готовят в зависимости от типа материала фильтра. Некоторые типы фильтров выпускают готовыми к использованию (например стекловолокнистые фильтры типа GF/F), другие требуют предварительного вымачивания или даже кипячения в воде. Например фильтры типа Synpor необходимо трижды прокипятить по 10—15 мин в свежих порциях дистилли­рованной воды. После кипячения следует провести выбраковку деформированных фильтров. Гото­вые фильтры хранят в сухом состоянии.

   3. Приготовление 1 дм³ 90 %-ного водного ацетона проводят смешением 0,9 дм³ 100 %-ного ацетона и 0,1 дм³ дистиллированной воды. В приготовленный раствор добавляют порцию MgCO₃ из расчета 1—2 г на 1 дм³ раствора, суспензию тщательно перемешивают в течение 20—30 с и хранят не более 3—5 сут в склянках из темного стекла.

   4. 0,5 см³ концентрированной соляной кислоты растворяют в 10 см³ ацетона. Приготовлен­ный раствор хранят не более суток.

7. ФИЛЬТРОВАНИЕ ПРОБ ВОДЫ И ХРАНЕНИЕ ФИЛЬТРОВ

   1. Объем пробы зависит от ожидаемой концентрации хлорофилла а в конкретном водном объекте и определяется в соответствии с приложением 2, при этом количество хлорофилла в пробе должно составлять от 2 до 20 мкг.

Из этих же соображений выбирается объем пробы грунта или льда при анализе микрофито­бентоса или ледовой микрофлоры.

Для получения на фильтре достаточно плотного и равномерного по толщине слоя ВаСО₃ и во избежание его взмучивания фильтрование необходимо проводить в следующей последовательности: заполнить фильтровальную воронку смесью фильтрата с порцией суспензии ВаСО₃, создать перепад давления, пропустить через фильтр некоторое количество фильтрата для полного осаждения ВаСО₃, после чего приступить к фильтрованию отобранной пробы.

В процессе фильтрования необходимо следить за уровнем воды в фильтровальной воронке и не допускать размывания слоя ВаСО₃ струей, поступающей в воронку.

После окончания фильтрования для подсушки фильтра следует поддержать перепад давления в течение еще 5—10 с.

При невозможности начать гомогенизацию и экстрагирование немедленно фильтр с осадком необходимо тщательно высушить, поместив его в эксикатор с силикагелем, и хранить в холодильнике при температуре минус 10—0 °С. Во избежание потерь вследствие рассыпания осадка с фильтров при их хранении и транспортировке допускается хранить фильтры свернутыми пополам осадком внутрь.

1. 7. Срок хранения должен быть по возможности сокращен и не превышать 1 мес (в моро­зильной камере при температуре ниже минус 20 °С — до 3 мес).

2. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

   1. Гомогенизация и экстрагирование. Слой ВаСО₃, содержащий отфильтрованную взвесь, снимают скальпелем с мембранного фильтра и количественно переносят в механический гомогени­затор. После добавления туда же нескольких кубических сантиметров 90 %-ного ацетона в течение 1 мин взвесь растирают. Для экстрагирования пигментов гомогенат в течение 30 мин выдерживают при комнатной температуре. Полученный экстракт сливают в центрифужную пробирку. Осадок повторно растирают в гомогенизаторе в течение 1 мин при добавлении новой порции 90 %-ного ацетона. Через 30 мин вторую порцию экстракта вместе с осадком сливают в ту же центрифужную пробирку. Остатки экстракта и взвеси со ступицы и пестика смывают минимальным количеством 90 %-ного ацетона и также сливают в центрифужную пробирку с экстрактом.