---

ГОСТ 30519-97

--------------------------

ГОСТ Р 50480-93

Группа Н09

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод выявления бактерий рода Salmonella

Food products. Method for detection of Salmonella

МКС 07.100.30

ОКСТУ 9109

Дата введения 1994-01-01

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1 РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП) и Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей"

2 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 26.12.93 N 24

Постановлением Госстандарта России от 16 апреля 1998 года N 122 ГОСТ 30519-97 введен в действие в качестве государственного стандарта Российской Федерации с момента принятия указанного постановления и признан имеющим одинаковую силу с ГОСТ Р 50480-93 на территории Российской Федерации в связи с полной аутентичностью их содержания

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4 ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске продукта бактерий рода Salmonella.

1 Сущность метода

Метод выявления бактерий рода Salmonella основан на высеве определенного количества продукта в жидкую неселективную среду, инкубировании посевов, последующем выявлении в этих посевах бактерий, способных развиваться в жидких селективных средах, образующих типичные колонии на агаризованных дифференциально-диагностических средах, имеющих типичные для бактерий рода Salmonella биохимические и серологические характеристики.

2 Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669 или по нормативно-технической документации на анализируемый продукт.

3 Аппаратура, материалы, реактивы

Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1, а также указанные ниже:

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);

_____________

* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 1 кг, 4-го класса точности (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический с увеличением 900-1000 ;

петлю бактериологическую;

стекла предметные по ГОСТ 9284;

стекла покровные по ГОСТ 6672;

термостат с диапазоном рабочих температур 28-55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ±1 °С.

спирт изобутиловый по ГОСТ 9536;

бриллиантовый зеленый;

желчь сухую или натуральную;

контрольный штамп* бактерий рода Salmonella, не относящихся к тифозной группе;

________________

* Текст соответствует оригиналу.

магний хлористый по ГОСТ 4209;

мочевину по ГОСТ 6691;

сухие агглютинирующие адсорбированные поливалентные сальмонеллезные сыворотки основных групп А, В, С, Д, Е и редких групп;

феноловый красный.

4 Подготовка к анализу

4.1 Приготовление растворов и реактивов

4.1.1 Раствор бриллиантового зеленого концентрации 5 г/дм : 0,5 г бриллиантового зеленого переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

4.1.2 Раствор фенолового красного концентрации 4 г/дм : 0,4 г фенолового красного переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

4.1.3 Реактив Эрлиха: 1,0 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 95 см этилового спирта объемной концентрации 96% и прибавляют 80 см концентрированной соляной кислоты ( =1,18-1,19 г/см ).

4.1.4 Реактив Ковача: перемешивают 5,0 г парадиметиламинобензальдегида, 25 см концентрированной соляной кислоты и 75 см изобутилового спирта.

4.1.5 Спиртовой раствор -нафтола концентрации 50 г/дм : 5,0 г -нафтола помещают в колбу вместимостью 100 см , растворяют в этиловом спирте объемной концентрации 96% и доводят раствор этиловым спиртом до метки. Раствор готовят непосредственно перед применением.

4.1.6 Спиртовой раствор фенолового красного концентрации 2 г/дм : 0,2 г фенолового красного переносят в колбу вместимостью 100 см , растворяют в этиловом спирте объемной концентрации 50% и доводят раствор этиловым спиртом до метки.

4.1.7 Сухие агглютинирующие адсорбционные поливалентные сальмонеллезные сыворотки готовят перед употреблением по прописи, указанной в прилагаемом к ним наставлении.

4.2 Приготовление питательных сред

4.2.1 Забуференная пептонная вода: 10,0 г пептона, 5,0 г хлористого натрия, 9,0 г двузамещенного фосфорно-кислого натрия (Na HPO ·12H O), 1,5 г однозамещенного фосфорно-кислого калия растворяют при нагревании в 1000 см дистиллированной воды, устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С 7,0±0,1. Разливают по колбам в количестве, зависящем от навески анализируемого продукта (если навеска равна 25 г, то разливают по 225 см , то есть 1:9), и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

4.2.2 Магниевая среда: готовят путем соединения трех растворов.

Приготовление раствора 1: 8,4 г пептона, 14,3 г хлористого натрия, 40 см дрожжевого экстракта, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 2,85 г однозамещенного фосфорно-кислого калия растворяют при нагревании в 1780 см дистиллированной воды.

Приготовление раствора 2: 71,4 г хлористого магния (MgCl ·6Н О) растворяют при нагревании в 180 см дистиллированной воды.

Раствор 3: берут 1,8 см раствора бриллиантового зеленого, приготовленного по 4.1.1.

Приготовленные растворы соединяют, устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С 7,2±0,2, разливают в колбы или флаконы по 100 см и стерилизуют при температуре (112±1) °С в течение 30 мин.

4.2.3 Селенитовая среда: готовят из двух растворов.

Приготовление раствора 1: 5,0 г пептона, 7,0 безводного двузамещенного фосфорно-кислого натрия, 3,0 г безводного однозамещенного фосфорно-кислого натрия, 4,0 г лактозы растворяют при нагревании в 1000 см дистиллированной воды, охлаждают до 45-55 °С, если необходимо, путем изменения соотношения фосфатных солей устанавливают рН 7,0±0,1. Среду разливают по 100 см в колбы или флаконы и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение двух дней или при температуре (112±1) °С в течение 30 мин.

Приготовление раствора 2: 10,0 г кислого селенисто-кислого натрия (NaHSeО ) растворяют асептически в 100 см стерильной дистиллированной воды. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

Приготовление среды: к 100 см раствора 1 прибавляют 4 см раствора 2.

Стерилизация приготовленной среды не допускается, так как при этом происходит редукция кислого селенисто-кислого натрия, выпадает осадок красного цвета и среда становится непригодной.

Селенитовая среда выпускается в сухом виде и готовится по прописи, указанной на этикетке.

4.2.4 Тетратионатная среда (Мюллер-Кауфман)

Приготовление основы среды: в 100 см мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, помещают 4,5 г стерильного углекислого кальция. Углекислый кальций стерилизуют по ГОСТ 10444.1.

Приготовленную основу стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

При приготовлении среды к 100 см основы среды асептически прибавляют:

10 см раствора гипосульфита натрия (Na S O ·5Н О);

2 см йодного раствора;

0,2 см раствора бриллиантового зеленого;

5 см раствора желчи.

Указанные растворы прибавляют к основе среды в приведенном выше порядке, перемешивая смесь после каждого прибавления.

Среду допускается использовать в течение одной недели после приготовления.

Указанные выше растворы, прибавляемые к основе среды, готовят следующим образом:

раствор гипосульфита натрия: 50,0 г гипосульфита натрия помещают в колбу вместимостью 100 см , растворяют в дистиллированной воде и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор переливают в колбу или флакон и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или при температуре (121±1) °С в течение 20 мин;

йодный раствор: 25,0 йодистого калия помещают в колбу вместимостью 100 см , растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, прибавляют 20,0 г кристаллического йода, растворяют его. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор хранят в плотно закрытом темном сосуде;

раствор бриллиантового зеленого готовят по 4.1.1;

раствор желчи: 10,0 г сухой желчи растворяют в 100 см дистиллированной воды или используют натуральную желчь. Раствор желчи или натуральную желчь стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

4.2.5 Дифференциально-диагностические среды (сухие):

висмут-сульфит агар (Вильсон-Блера);

среду Плоскирева;

среду Эндо;

среду Левина.

Среды готовят по прописи, указанной на этикетке.

4.2.6 Трехсахарный агар: 10,0 г пептона, 3,0 г сухого дрожжевого экстракта или 15 см дрожжевого экстракта, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 10,0 г лактозы, 10,0 г сахарозы, 1,0 г глюкозы, 0,3 г цитрата железа (или 0,2 г аммоний-железо сульфата (NН ) Fe(SO ) ·6Н О или 0,2 г сернокислого железа FeSO ·6Н О), 0,3 г гипосульфита натрия, 6 см раствора фенолового красного, приготовленного по п.4.1.2, 15,0 г агара растворяют при нагревании в 1000 см мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С 7,2±0,2. Среду разливают в пробирки по 6-7 см и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 10 мин.

4.2.7 Агар Кристенсена с мочевиной: среда готовится путем соединения основы среды и раствора мочевины.

Основа среды: 1,0 г пептона, 1,0 г глюкозы, 5,0 г хлористого натрия, 2,0 г безводного однозамещенного фосфорнокислого калия, 3 см раствора фенолового красного, приготовленного по 4.1.2, 15,0 агара растворяют при нагревании в 1000 см дистиллированной воды, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С 6,7±0,1.

Основу среды мерно разливают в колбы или флаконы и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 20 мин.

Раствор мочевины концентрации 400 г/дм : 40,0 г мочевины помещают в колбу вместимостью 100 см , растворяют в дистиллированной воде, объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор мочевины стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 или текучим паром в течение 30 мин.

При приготовлении среды к 950 см основы прибавляют асептически 50 см раствора мочевины, разливают в стерильные пробирки по 6-7 см .

4.2.8 После стерилизации среды, приготовленные по 4.2.6 и 4.2.7, скашивают так, чтобы оставался столбик высотой 2-2,5 см.

4.2.9 Полужидкий мясо-пептонный агар: готовят по ГОСТ 10444.1 так же, как мясо-пептонный агар, но при приготовлении добавляют 4,0-8,0 г агара на 1000 см мясо-пептонного бульона, перед стерилизацией среду разливают по 6-7 см в пробирки.

4.2.10 Мясо-пептонный бульон с глюкозой: готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6-7 см .

4.2.11 Бульон Хоттингера: готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6-7 см .

4.2.12 Мясо-пептонный бульон с 0,05% L-триптофана: 0,05 L-триптофана растворяют в 100 см мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6-7 см и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

4.2.13 Среды с углеводами (среды Гисса): готовят по ГОСТ 10444.1 или используют сухие среды с углеводами, которые готовят по прописи, указанной на этикетке.

4.2.14 Мясо-пептонный агар: готовят по ГОСТ 10444.1 или используют среду, приготовленную из сухого питательного агара.

Среду из сухого питательного агара готовят по прописи, указанной на этикетке.

5 Проведение анализа

5.1 Неселективное предварительное обогащение

Навеску продукта, в массе (объеме) которой нормативно-технической документацией на анализируемый продукт предусматривается отсутствие бактерий рода Salmonella, высевают в забуференную пептонную воду, приготовленную по 4.2.1. Соотношение массы (объема) продукта и забуференной пептонной воды 1:9.