Группа Н09
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum
Food products. Methods for detection of botulinal
toxins and Clostridium botulinum
ОКСТУ 9109
Дата введения 1987-07-01
ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 12 мая 1986 г. N 1214
ВЗАМЕН ГОСТ 10444.7-75, ГОСТ 10444.8-75
ПЕРЕИЗДАНИЕ
Настоящий стандарт устанавливает методы выявления в пищевых продуктах ботулинических токсинов всех типов, вегетативных клеток и спор токсигенных штаммов Clostridium botulinum, определения титра ботулинических токсинов, серологического типирования токсина и выделения культур токсигенных штаммов С.botulinum типа А, В, С, D, Е, F и G.
Метод выявления ботулинического токсина и определение его титра основан на выявлении симптомов клинической картины болезни и гибели животных, характерных для ботулинической интоксикации.
Серологическое типирование токсина С.botulinum осуществляется на белых мышах путем постановки защитного теста in vivo или реакции нейтрализации in vitro с диагностическими противоботулинистическими типоспецифическими антитоксическими сыворотками.
Метод выявления С.botulinum основан на его способности развиваться и образовывать ботулинические токсины в питательных средах для анаэробных микроорганизмов.
Выделение культур токсигенных штаммов С.botulinum из продукта или культуральной жидкости проводят путем высева на твердые питательные среды с последующим исследованием культуральных и морфологических признаков, характерных для С.botulinum, и определением способности выделенной культуры образовывать ботулинический токсин.
Методы предназначены:
для исследования продуктов по санитарно-эпидемиологическим показаниям;
для анализа посевов продуктов, в случае обнаружения в них мезофильных анаэробных микроорганизмов.
Исследования проводят в лабораториях, указанных органами здравоохранения.
Термины, применяемые в настоящем стандарте, и пояснения к ним приведены в приложении 1.
Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 5211-65.
1. МЕТОДЫ ОТБОРА И ПОДГОТОВКА ПРОБ
1.1. Методы отбора проб пищевых продуктов - по ГОСТ 26668-85 и в соответствии с требованием приложения 4. Пробы пищевых продуктов подготавливают к анализу по ГОСТ 26669-85. Консервы и полуконсервы проверяют на герметичность по ГОСТ 8756.18-70 и термостатируют по ГОСТ 26669-85.
1.2. Термостатированию не подлежат: консервы и полуконсервы в негерметичной таре, бомбажные, хлопуши, консервы с видимыми невооруженным глазом признаками развития микроорганизмов и предназначенные для одновременного выявления ботулинических токсинов и С.botulinum или только ботулинических токсинов.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И РАСТВОРЫ
2.1. Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы, реактивы и растворы по ГОСТ 10444.1-84, а также аппаратуру, материалы, реактивы и растворы, указанные ниже:
анаэростат;
аппарат для встряхивания;
баллоны с газами (азот, водород, гелий или смесью: азот 80%, углекислый газ - 10%, водород - 10%);
весы аналитические;
грушу резиновую;
доски для сушки посуды;
ерши для мойки посуды;
корзинки проволочные луженые для стерилизации;
микроскоп биологический с приспособлением для фазовоконтрастного микроскопирования;
микропипетки;
пестик для фарфоровой ступки;
петли бактериологические;
пипетки пастеровские;
пробирки центрифужные вместимостью 10-100 см ;
размельчитель тканей лабораторный;
редукторы к баллонам с газом;
стекла предметные по ГОСТ 9284-75;
стекла покровные по ГОСТ 6672-75;
фильтры асбестовые, керамические, мембранные;
флаконы вместимостью 100-500 см ;
футляры металлические для стерилизации пипеток, чашек Петри, шприцев;
штативы для пипеток;
штативы для пробирок;
бумагу индикаторную;
дуршлаг;
масло иммерсионное;
перчатки резиновые;
фильтр тканевый;
мышей белых массой 15-20 г одного пола;
бриллиантовый зеленый, раствор: 0,5-1,0 г бриллиантового зеленого растворяют в 100 см этилового спирта. Применяют для метки белых мышей;
кальций углекислый стерильный готовят по ГОСТ 10444.1-84. Добавление углекислого кальция к средам с глюкозой способствует образованию спор С.botulinum;
кислоту аскорбиновую, раствор массовой концентрацией 50 г/дм : 5 г аскорбиновой кислоты переносят в мерную колбу вместимостью 100 см , доводят объем дистиллированной водой до метки, растворяют и стерилизуют фильтрованием, используя фильтры со средним диаметром пор 0,40-0,45 мкм. Раствор следует применять свежеприготовленным. Допускается использовать без стерилизации раствор аскорбиновой кислоты для инъекций. Применяют в качестве восстановителя, связывающего кислород в питательных средах для С.botulinum;
кислоту молочную, - форма по ГОСТ 490-79;
кислоту пикриновую, раствор: 2,5 пикриновой кислоты растворяют в 100 см воды при нагревании. Применяют для метки белых мышей;
кислоту соляную по ГОСТ 3118-77, раствор с массовой долей соляной кислоты 4%. Применяют для подкисления питательных сред;
масло вазелиновое по ГОСТ 3164-78 или подсолнечное по ГОСТ 1129-93; масло вазелиновое разливают в колбы по 20-50 см и стерилизуют горячим воздухом в стерилизаторе в течение 60 мин при температуре 140 °С; масло подсолнечное прокаливают при температуре (160±1) °С горячим воздухом в стерилизаторе в течение 2 ч, охлаждают, фасуют в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 30 мин;
мальтозу;
малахитовый зеленый;
медь сернокислую по ГОСТ 4165-78, 1%-ный раствор. Применяют для постановки биуретовой реакции в питательных средах;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, раствор с массовой долей гидроокиси натрия 4%. Применяют для подщелачивания питательных сред;
натрий углекислый по ГОСТ 83-79, 0,3-1%-ный раствор. Применяют для кипячения игл для шприцев (см. приложение 3);
натрия тиогликолят;
неомицин;
перекись водорода по ГОСТ 177-88, раствор с массовой долей перекиси водорода 3%;
растворы фосфатного буфера:
для приготовления фосфатного буфера готовят растворы:
А - раствор однозамещенного фосфорнокислого калия (KН РО - квалификации х.ч., дважды перекристаллизованный или для рН-метрии) массовой концентрацией 9,078 г/дм ;
Б - раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na HPO ·2H O квалификации х.ч., дважды перекристаллизованный) массовой концентрацией 11,876 г/дм ;
для приготовления 100 см фосфатного буфера:
рН 6,0 - к 12 см раствора Б добавляют 88 см раствора А;
рН 6,2 - к 18,5 см раствора Б добавляют 81,5 см раствора А;
рН 6,8 - к 50 см раствора Б добавляют 50 см раствора А;
раствор фосфатного буфера рН 6,0 применяют для растворения трипсина;
растворы желатино-фосфатного буфера:
в 100 см фосфатного буферного раствора с определенным значением рН вносят 0,6 г желатина, дают набухнуть желатину и нагревают до полного растворения желатина. Стерилизуют при температуре (110±1) °С в течение 15 мин;
раствор желатино-фосфатного буфера рН 6,2 применяют в качестве стабилизатора ботулинических токсинов. В случае выявления ботулинического токсина типа А переходят на раствор желатино-фосфатного буфера рН 6,8;
смесь реактивов для создания анаэробных условий готовят по ГОСТ 10444.1-84. Допускается использование талька вместо инфузорной земли;
трипсин, раствор: 1,5 г трипсина растворяют в 100 см раствора фосфатного буфера рН 6,0. Раствор трипсина стерилизуют фильтрованием через керамический или мембранный фильтр с размерами пор 0,40-0,45 мкм или другой эквивалентный фильтр. Стерильный раствор трипсина вносят в регенерированную и охлажденную питательную среду асептически непосредственно перед использованием из расчета 1 см раствора трипсина на 15 см среды. Применяют для активизации протоксина С.botulinum;
гидролизат казеина ферментативный;
фломастеры (применяют для метки мышей);
циклосерин;
эмульсию яично-желточную: свежие куриные яйца моют, ополаскивают холодной водой, опускают в 70%-ный спирт и высушивают. Разбивают каждое яйцо, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри и отделяют желток от белка. Помещают желтки в стерильную колбу или флакон с четырьмя объемами стерильной воды и энергично перемешивают. Нагревают смесь на водяной бане при температуре (45±0,5) °С в течение 2 ч, оставляют на 18-24 ч при температуре от 0 до плюс 5 °С для того, чтобы сформировался осадок.
С соблюдением правил асептики собирают эмульсию над осадком. Эмульсию хранят при температуре 0 - плюс 5 °С не более 72 ч. Применяют для определения способности С.botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.
3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
3.1. При приготовлении питательных сред для выявления и культивирования С.botulinum жидкие и полужидкие среды разливают во флаконы или в пробирки таким образом, чтобы высота столбика среды составляла не менее 10 см, объем среды - 30-100 см .
Если нет специальных указаний по хранению среды, то среду хранят в темноте при температуре (4±2) °С не более 1 мес. Сухие среды, в состав которых входят тиогликолят натрия и цистеина гидрохлорид, хранят в герметичной упаковке при температуре (4±2) °С. Приготовленные из них жидкие и полужидкие среды хранят при комнатной температуре не более 7 сут.
3.2. Для выявления и выделения С.botulinum используют следующие среды.
3.2.1. Агар желточный для анаэробов: к 1000 см дистиллированной воды добавляют 25,0 см дрожжевого экстракта, 5,0 г триптона или ферментативного гидролизата казеина, 20,0 г пептона, 5,0 г хлористого натрия и 20,0 г агара. Среду нагревают на кипящей водяной бане до расплавления агара, устанавливают рН (6,9±0,1), разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин. Хранят при температуре (4±2) °С не более 28 сут.
Яично-желточную эмульсию добавляют к расплавленной и охлажденной до 50 °С среде из расчета 80 см яично-желточной эмульсии на 1000 см среды, тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри. Чашки хранят при температуре (4±2) °С не более 2 сут, перед использованием подсушивают по ГОСТ 26670-91. Применяют для определения способности С.botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.
3.2.2. Агар печеночно-желточный; агар печеночный готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Яично-желточную эмульсию добавляют к расплавленному и охлажденному до 50 °С печеночному агару из расчета 80 см желточной эмульсии на 1000 см агара, тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри. Чашки хранят при температуре (4±2) °С не более 2 сут, перед использованием подсушивают по ГОСТ 26670-91.
При отсутствии печеночного агара допускается заменять его мясо-пептонным агаром.
Применяют для определения способности С.botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.
3.2.3. Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1-84.
3.2.4. Агар сахарный кровяной по Цейсслеру готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют при определении гемолитической активности С.botulinum.
3.2.5. Бульон триптиказо-пептонно-глюкозный с дрожжевым экстрактом (ТРGУ) и с трипсином (ТРGУТ): 50,0 г триптического перевара казеина, 5,0 г пептона, 100,0 см дрожжевого экстракта, 4,0 г глюкозы и 1,0 г тиогликолята натрия добавляют к 900 см дистиллированной воды, устанавливают рН (7,1±0,1). Стерилизуют при температуре (121±1) °С пробирки в течение 10 мин, флаконы - в течение 15 мин. Хранят при комнатной температуре не более 7 сут.
Для культивирования С.botulinum, образующих протоксин, перед употреблением к 1000 см бульона добавляют 60 см 1,5%-ного раствора трипсина в фосфатном буферном растворе.
3.2.6. Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют для культивирования С.botulinum.
3.2.7. Среду из вареного мяса (Cook-Meat Medium) готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют для выделения и культивирования С.botulinum.
3.2.8. Среду Китт-Тароцци с углекислым кальцием готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют для выявления и культивирования С.botulinum.
3.2.9. Среду печеночно-глицериновую готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют для культивирования С.botulinum.
3.2.10. Среду питательную для контроля стерильности, сухую.
В состав среды входят:
фермент активный гидролизат казеина неглубокой степени расщепления - 15,0 г;
витаминный препарат экстракта кормовых дрожжей 5,0 г;
натрий хлористый - 6,4 г;
глюкоза - 5,0 г;
тиогликолят натрия - 0,3 г;
цистеина гидрохлорид - 0,75 г;
агар - 0,6 г;
натрий углекислый - 0,5-0,95 г;
33,0 г сухого порошка растворяют в 1000 см воды, тщательно размешивают, доводят до кипения, кипятят 2-3 мин при помешивании, фильтруют, разливают во флаконы. Стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин. Готовая среда должна иметь рН (7,0±0,2).
Среду хранят при комнатной температуре не более 7 сут.
Применяют для культивирования С.botulinum.
3.2.11. Улучшенную клостридиальную среду (R. С. М.) готовят по ГОСТ 10444.1-84.
Применяют для культивирования С.botulinum.
