Страница 2: Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I - IV груп патогенності молекулярно-генетичними методами (45133)

3.1.6. Роботу з ПЛР-діагностики організовує і проводить спеціаліст з вищою спеціальною освітою, який має сертифікат лікаря-спеціаліста з лікарських спеціальностей "бактеріологія", "вірусологія" або "мікробіологія і вірусологія" та пройшов курси спеціалізації, стажування або інші види підготовки, має необхідну за програмою теоретичну і практичну підготовку за своєю спеціальністю, відповідно до Положення про порядок проведення атестації лікарів, затвердженого наказом МОЗ України від 19.12.97 N 359, зареєстрованого в Міністерстві юстиції України 14.01.98 за N 14/2454.

Приймання матеріалу, ведення записів у журналах, виконання допоміжних маніпуляцій при проведенні досліджень та деяких етапів аналізу, дезінфекцію, знешкодження матеріалу тощо здійснюють лаборанти, які отримали свідоцтво про проходження підвищення кваліфікації та перепідготовки молодших медичних та фармацевтичних спеціалістів відповідно до Положення про Свідоцтво про проходження підвищення кваліфікації та перепідготовки молодших медичних та фармацевтичних спеціалістів, затвердженого наказом МОЗ України від 07.09.93 N 198, зареєстрованого в Міністерстві юстиції України 31.12.93 за N 208.

Кваліфікаційні вимоги до працівників лабораторій викладені у Довіднику кваліфікаційних характеристик професій працівників. Випуск 78. Охорона здоров'я, затвердженому наказом МОЗ України від 29.03.2002 N 117.

3.1.7. Кожен працівник повинен мати посадову інструкцію, що встановлює вимоги до освіти, функції, обов'язки, права, відповідальність, затверджену керівником установи.

3.1.8. Результати та протоколи досліджень реєструють на паперових та електронних носіях, а також на фотоплівках, фотографіях, які зберігають у лабораторії впродовж трьох років. Електрофореграми є невід'ємною частиною протоколу дослідження.

3.1.9. Відповіді про результати дослідження видають письмово в установленій формі за підписом лікаря, який виконував дослідження.

3.1.10. Лабораторію забезпечують аптечкою стандартної комплектації для надання першої медичної допомоги.

3.1.11. Для виконання досліджень за методом NASBA-Real-Time вимоги до організації роботи такі ж, як і для ПЛР-лабораторій, що використовують флуоресцентну детекцію.

3.2. Вимоги до приміщень ПЛР-лабораторії

3.2.1. Приміщення ПЛР-лабораторії, яка проводить роботи з БПА I - II груп патогенності або матеріалом, підозрюваним на наявність в ньому цих БПА, повинні відповідати вимогам ДСП 9.9.5.035.99; при роботі з БПА III - IV груп патогенності або матеріалом, підозрюваним на наявність в ньому цих БПА, повинні відповідати вимогам ДСП 9.9.5.-080-2002, а також цих Правил.

3.2.2. Проведення досліджень методом ПЛР з БПА I - IV груп патогенності допускається на базі діючих лабораторій мікробіологічного профілю за умови дотримання вимог ДСП 9.9.5.035.99 та ДСП 9.9.5.-080-2002 і організації в лабораторії відокремлених робочих зон, що дозволяють дотримуватись вимог протиепідемічного режиму роботи та відповідають етапам ПЛР-дослідження.

Не допускається проведення досліджень методом ПЛР в приміщеннях, де проводять дослідження з використанням культуральних (накопичення БПА) і генно-інженерних методів.

Приміщення, в яких проводять дослідження, спрямовані на виявлення НК мікроорганізмів, бажано виділити в окремий блок. При будівництві нових або реконструкції існуючих приміщень ПЛР-лабораторію розміщують в окремій будівлі (ізольованій частині будівлі) з дотриманням вимог ДСП 9.9.5.035.99, ДСП 9.9.5.-080-2002 та цих Правил.

3.2.3. ПЛР-лабораторія повинна мати дві умовні зони "чисту" і "брудну" та включати такий мінімальний набір робочих приміщень:

"чиста" зона:

- приміщення прийому, реєстрації, розбору і первинної обробки матеріалу;

- приміщення для виділення НК;

- приміщення приготування реакційних сумішей і проведення ПЛР - ампліфікаційна;

"брудна" зона:

- приміщення детекції продуктів ампліфікації (при застосуванні методів електрофорезу або ГІФА) - форезна;

- секвенаторна.

3.2.4. Робочі приміщення ПЛР-лабораторії повинні бути непрохідними і створеними за типом боксів з передбоксами. Площа кожного із робочих приміщень ПЛР-лабораторії повинна бути не меншою ніж на одне робоче місце, у тому числі передбокс не менше . При збільшенні робочих місць площу слід збільшувати на на кожне робоче місце, тобто S = 12 + 6 х (n - 1) м2, де n - кількість робочих місць.

3.2.5. ПЛР-лабораторія, що функціонує як самостійна структура, повинна мати додатково такі приміщення - кімнату для роботи з документами (кімнату персоналу), кабінет завідувача лабораторією (може бути об'єднаний з кімнатою персоналу); роздягальні для співпрацівників; кімнату прийому їжі; туалет; душові для "чистої" та "брудної" зон ПЛР-лабораторії окремо, підсобні (складські) приміщення, приміщення для знезараження матеріалу та автоклавну, а також приміщення, вказані в підпункті 3.2.3 пункту 3.2 цих Правил, для проведення ПЛР-аналізу. Примірна схема організації ПЛР-лабораторії наведена на малюнку 1.

Малюнок 1. Примірна схема організації ПЛР-лабораторії

Умовні позначення

1 - Зона прийому, реєстрації, розбору і первинної обробки матеріалу; 2 - Зона виділення НК; 3 - Зона приготування реакційних сумішей, проведення ЗТ та ПЛР; 4 - Зона детекції продуктів ампліфікації методом електрофорезу або ГІФА; 5 - Кімната аналізу результатів; 6 - Передбокс; 7 - Кімната знезараження матеріалу.

3.2.6. У приміщенні прийому, реєстрації, розбору і первинної обробки матеріалу проводять попередню пробопідготовку (сортування, маркування, центрифугування та інше), зберігання і первинну інактивацію залишків біологічного матеріалу дезінфекційними засобами. Тут же можна проводити прийом і обробку проб для дослідження іншими методами (бактеріологічним, вірусологічним, імунологічним тощо) за умови виділення окремого обладнаного робочого місця для пробопідготовки до ПЛР-аналізу.

Усі маніпуляції, що супроводжуються ризиком утворення аерозолів (струшування, центрифугування тощо), при обробці матеріалу виконують у боксах безпеки II або III класу (в залежності від групи патогенності мікроорганізму, наявність якого підозрюють у досліджуваному матеріалі).

3.2.7. Зону виділення НК розташовують в окремому приміщенні. При організації ПЛР-лабораторії на базі діючої мікробіологічної лабораторії допускається виділення НК в приміщеннях, в яких проводять серологічні дослідження, а в лабораторіях, що працюють із збудниками I - II груп патогенності, - в кімнаті зараження та розтину тварин. У цих випадках в приміщенні організовують робочу зону для виділення НК, в якій встановлюють бокс біологічної безпеки відповідно II або III класу. У робочій зоні розташовують обладнання та предмети, які необхідні тільки для виділення НК. У боксі біологічної безпеки для виділення НК не допускається проведення інших робіт.

Виділення НК з клінічного матеріалу та проб з об'єктів довкілля проводять у іншому боксі безпеки, ніж при дослідженні харчових продуктів на показники безпеки або наявність генетично-модифікованих організмів. Крім того, доцільно розмежувати процеси виділення НК з крові/сироватки та інших видів клінічного матеріалу (в окремих боксах безпеки або в різний час, після попередньої обробки).

3.2.8. Приміщення ампліфікаційної має бути окремим. У ньому проводять приготування реакційної суміші, внесення до пробірки для ПЛР виділених препаратів ДНК або компліментарної ДНК (далі - кДНК), зворотну транскрипцію (далі - ЗТ) РНК та ампліфікацію ДНК або кДНК.

Для приготування реакційної суміші і внесення в реакційну суміш препаратів НК встановлюють окремі ПЛР-бокси.

У ПЛР-лабораторіях з великим обсягом однотипних досліджень для приготування реакційної суміші обладнують окрему боксовану кімнату, яка функціонально, через шлюзове вікно, пов'язана з кімнатою для внесення виділених препаратів НК та проведення ампліфікації.

3.2.9. Кімнату детекції продуктів ампліфікації розташовують в окремому приміщенні, максимально віддаленому від "чистої" зони ПЛР-лабораторії. Створюють усі умови для розмежування персоналу, що працює у "чистій" зоні від персоналу, що працює у "брудній" зоні.

3.2.10. При необхідності використання для детекції продуктів ампліфікації разом з методом електрофорезу і методу ГІФА необхідно виділити окреме приміщення або окрему робочу зону для проведення гібридизаційного аналізу (відповідно площа цього приміщення повинна бути збільшена як для приміщення на 2 робочих місця). Обладнання для кожного виду детекції маркують для кожної зони. Не допускається при проведенні ГІФА використання піпеток і посуду, призначених для електрофорезу.

3.2.11. При використанні в ПЛР-лабораторії методу ПЛР з флуоресцентною детекцією, як єдиного методу, окрему кімнату детекції продуктів ампліфікації не організовують.

3.2.12. Автоклавна кімната може бути спільною для ПЛР-лабораторії та інших підрозділів лабораторії, на базі якої розташована ПЛР-лабораторія, і функціонувати за умови дотримання вимог біологічної безпеки.

3.2.13. Для вивчення послідовності нуклеотидів у ДНК (секвенування) необхідно виділяти окреме приміщення - секвенаторну у "брудній" зоні ПЛР-лабораторії, яке має бути розташоване поруч з приміщенням детекції продуктів ампліфікації. При цьому слід передбачити збільшення площі приміщення детекції продуктів ампліфікації, оскільки в ньому треба буде розмістити додаткове обладнання для секвенування: настільну центрифугу з охолодженням та змінними роторами, облаштувати стіл для проведення очистки та перевірки якості отриманого продукту ПЛР.

3.2.14. Приміщення секвенаторної влаштовують за типом бокса з передбоксником загальною площею не менше , в тому числі - робоча кімната. Передбоксник обладнують водопостачанням та каналізацією.

3.2.15. Підготовка зразка для завантаження його у секвенатор складається з кількох основних етапів (та може розрізнятися в залежності від методики, що використовується):

- виділення НК з клінічного матеріалу проводиться у кімнаті виділення НК, як для ПЛР у класичному форматі;

- ампліфікація ділянки НК, що охоплює зону інтересу (якщо це РНК - необхідним є етап ЗТ для отримання кДНК), проводиться в приміщенні ампліфікаційної;

- очистка отриманого ампліфікованого продукту ПЛР-реакції (від праймерів, залишкових дезоксинуклеотидів, ферментів, матричної НК, неспецифічних ПЛР-продуктів) проводиться у форезній. Використовуються такі методи очистки: за допомогою електрофорезу в агарозному гелі; на колонках; ферментативна очистка;

- оцінка якості/кількості ДНК (з наступним розведенням при необхідності) за допомогою агарозного електрофорезу чи спектрофотометрично проводиться у форезній;

- проведення ПЛР з використанням термінаторів проводиться у секвенаторній;

- доочистка отриманого ампліфікованого продукту після реакції з термінаторами (від солей, надлишкових дидезоксинуклеотидів) проводиться у форезній. Використовуються такі методи очистки: очистка етанолом, ізопропанолом, гель-фільтрація, мембранна фільтрація;

- ресуспендування зразка (у формаміді або воді) проводиться у форезній;

- завантаження зразка у секвенатор.

3.2.16. Незалежно від протоколу, що буде використовуватись, необхідним є таке обладнання для секвенаторної:

- низькотемпературні холодильники для зберігання зразків та реагентів;

- ПЛР-бокс;

- дозатори на різні об'єми;

- ампліфікатор (для проведення класичної ПЛР);

- вортекс;

- секвенатор.

В залежності від методики необхідними можуть бути обладнання для проведення електрофорезу з системою документації, спектрофотометр, центрифуги зі змінними роторами та охолодженням.

3.2.17. Планувальні рішення і розміщення обладнання повинні забезпечувати поточність руху досліджуваного матеріалу за технологічним процесом. Слід повністю виключити обмін повітря між приміщеннями "брудної" зони та іншими приміщеннями ПЛР-лабораторії.

Рух матеріалу у зворотному напрямку категорично заборонено.

3.2.18. ПЛР-лабораторія повинна бути обладнана водопроводом, каналізацією, забезпечена електрикою і опалюванням відповідно до чинного законодавства. Усі приміщення лабораторії повинні бути забезпечені достатнім природним і штучним освітленням. В передбокснику кожної робочої кімнати повинна бути раковина для миття рук.

3.2.19. При будівництві нових або реконструкції існуючих ПЛР-лабораторій приміщення слід обладнувати припливно-витяжною або витяжною вентиляцією. Різниця в тиску повітря в приміщеннях ПЛР-лабораторії досягається за рахунок різного за кратністю обміну повітря в них.

Кратність обміну повітря в приміщеннях ПЛР-лабораторії повинна відповідати значенням, наведеним в таблиці 1.

Таблиця 1.

Кратність обміну повітря (м3/год) у приміщеннях ПЛР-лабораторій