ГОСТ 30347-97


Группа Н19

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ



МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ


Методы определения Staphylococcus aureus


Milk and milk products. Methods for determination of staphylococcus aureus



МКС 07.100.30

ОКСТУ 9209

Дата введения 1998-07-01

ПРЕДИСЛОВИЕ


1 РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности (ВНИМИ) и Межгосударственным и техническим комитетом по стандартизации МТК 186 "Молоко и молочные продукты"


ВНЕСЕН Госстандартом Российской Федерации


2 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 11 от 25 апреля 1997 года)


За принятие проголосовали:


Наименование государства


Наименование национального органа по стандартизации

Азербайджанская Республика


Азгосстандарт

Республика Армения


Армгосстандарт

Республика Беларусь


Госстандарт Республики Беларусь

Кыргызская Республика


Кыргызстандарт

Республика Молдова


Молдовастандарт

Российская Федерация


Госстандарт России

Республика Таджикистан


Таджикгосстандарт

Туркменистан


Главгосинспекция "Туркменстандартлары"

Республика Узбекистан


Узгосстандарт

Украина


Госстандарт Украины



3 Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации, метрологии и сертификации от 25 сентября 1997 года N 341 межгосударственный стандарт ГОСТ 30347-97 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 июля 1998 года.


4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


5 ПЕРЕИЗДАНИЕ




1 Область применения


Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочные продукты, закваски, бактериальные концентраты и препараты и устанавливает два метода определения Staphylococcus aureus в определенном объеме или навеске продукта - определение количества с предварительным обогащением; определение количества без предварительного обогащения.


Метод определения Staphylococcus aureus с предварительным обогащением основан на высеве навески продукта и разведении его в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве на плотные селективные среды с последующим подтверждением принадлежности выросших колоний к Staphylococcus aureus.


Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения посевом на агаризованные селективные среды основан на высеве продукта или разведении его на поверхности плотной среды, инкубировании, подсчете типичных колоний Staphylococcus aureus с последующим подтверждением выросших колоний к Staphylococcus aureus по плазмокоагулирующей способности.




2 Нормативные ссылки


В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:


ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа


ГОСТ 10444.11-89 Продукты пищевые. Методы определения молочно-кислых микроорганизмов


ГОСТ 27583-88* Яйца куриные пищевые. Технические условия

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52121-2003.




3 Средства контроля и вспомогательные устройства


3.1 Аппаратура, материалы, реактивы по ГОСТ 9225 со следующими дополнениями:


сухая плазма кроличья, цитратная;


контрольный штамм Staphylococcus aureus;


мембранные фильтры;


калия теллурит [2], раствор с массовой концентрацией 10 г/дм ;


глицин [1], раствор с массовой концентрацией 200 г/дм ;


кристаллический фиолетовый [6];


натрия пируват [8], раствор с массовой концентрацией 200 г/дм ;


литий хлористый, гексагидрат [4];


триптон;


экстракт дрожжевой [3] или


экстракт дрожжевой, очищенный [7];


экстракт мясной;


фуксин основной [5], спиртовой раствор с массовой концентрацией 50 г/дм ;


яйца куриные пищевые по ГОСТ 27583


витаминный препарат "ЭКД" сухой [11].


3.2 Питательные среды


3.2.1. Гидролизованное и стерильное обезжиренное молоко по ГОСТ 10444.11 (3.3.1 и 3.3.3).


3.2.2. Среды питательные сухие для определения Staphylococcus aureus [9] или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой и питательный агар сухой II, выпускаемые Дагестанским НПО "Питательные среды" [10].


3.2.3. Желточную эмульсию готовят следующим образом.


Свежее куриное яйцо моют водопроводной водой, затем протирают ваткой, смоченной в спирте, и обсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см стерильного раствора хлористого натрия по ГОСТ 9225. Тщательно перемешивают. Приготовленная эмульсия может храниться при температуре 0-5 С° не более 72 ч.


3.2.4 Солевой бульон*:


Состав: натрий хлористый (NaCl) - 7,5 г;


питательный сухой бульон - 1,5 г;


или гидролизованное молоко - 100 см .

________________

* Допускается применение солевого бульона [9], который готовится согласно указанию на этикетке.


Приготовление: в 100 см дистиллированной воды вносят 1,5 г сухого питательного бульона, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9±0,1).


Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение (10±1) мин.


Или к 100 см гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9±0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.


3.2.5 Желточно-солевой агар*

________________

* Допускается использовать солевой агар [9], который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.


Состав: питательный агар*


для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) [10] - 35 г


или


питательный агар II*


(на основе гидролизата кормовых дрожжей) [10] - 24 г;


натрий хлористый (NaCl) - 75 г;


эмульсия желточная - 50,0 см ;


вода дистиллированная - 1 дм .

________________

* При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.


Приготовление: в 1 дм дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 75 г хлористого натрия (NaCl), кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватный тампон, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение (20±1) мин. После стерилизации охлаждают до температуры (45±1) °С и добавляют 50 см предварительно подготовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.


3.2.6 Молочно-солевой агар*

________________

* Допускается использовать солевой агар [9], который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.


Состав: питательный агар* для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) [10] - 35 г


или питательный агар II* (на основе гидролизата кормовых дрожжей) [10] - 24,0 г;


натрий хлористый (NaCl) - 75,0 г;


молоко обезжиренное - 100 см ;


вода дистиллированная - 1 дм .

________________

* При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.


Приготовление: среду готовят, как указано в 3.2.5, но после охлаждения до температуры (45±1) °С добавляют вместо желточной эмульсии 100 см стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.


3.2.7 Агар Байрд-Паркера *

_________________

* Допускается использовать агар Байрд-Паркера [9]. Среда готовится согласно указанию на этикетке.


Состав. Основа среды:


триптон - 10,0 г;


дрожжевой экстракт [3] - 1,0 г;


мясной экстракт - 5,0 г;


литий хлористый, гексагидрат [4] - 5,0 г;


агар - 12,0-20,0 г;


вода дистиллированная - 1 дм .


Раствор пирувата натрия:


пируват натрия [8] - 20,0 г;


вода дистиллированная - 100 см .


Раствор глицина:


глицин [1] - 20,0 г;


вода дистиллированная - 100,0 см .


3.2.7.1 Приготовление основы среды: в 1 дм дистиллированной воды вносят 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара.


При отсутствии триптона применяют гидролизат казеиновый сухой, а при отсутствии дрожжевого экстракта применяют витаминный препарат "ЭКД" сухой [11].


При отсутствии мясного экстракта, триптона и дрожжевого экстракта вместо дистиллированной воды применяют 1 дм мясопептонного бульона или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой или питательный агар сухой II [10].


Все компоненты, внесенные в 1 дм дистиллированной воды (мясопептонный бульон), нагревают и перемешивают до полного растворения, охлаждают до температуры 50-60 °С. Устанавливают рН (7,2±0,1), разливают в колбы или бутылки по 90 см и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение (20±1) мин.


При использовании сухой среды в 1 дм дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 5 г хлористого лития. Нагревают до полного растворения, охлаждают до температуры 50-60 °С, устанавливают рН (7,2±0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.


Готовую основу среды хранят не более 30 сут при температуре (6±2) °С.


3.2.7.2 Перед использованием к 90 см расплавленной основы среды добавляют асептически стерилизованные фильтрованием через мембранный фильтр растворы: 6,3 см раствора глицина, 5 см раствора пирувата натрия; 1 см раствора теллурита калия; 5 см желточной эмульсии.


Допускается растворы глицина, пирувата натрия, теллурита калия и желточную эмульсию готовить в асептических условиях на стерильной дистиллированной воде.


После тщательного перемешивания приготовленную среду разливают в чашки Петри.


Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.




4 Порядок подготовки к проведению контроля


4.1 Приготовление растворов и реактивов


4.1.1. Раствор плазмы кроличьей цитратной готовится согласно инструкции по применению плазмы, прилагаемой к упаковке.


4.1.2. Растворы и реактивы для окраски препаратов готовят по ГОСТ 9225.


4.1.3. Приготовление реактивов для окраски по Граму


4.1.3.1 Приготовление реактива 1


В 100 см этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового [6].


4.1.3.2 Приготовление реактива 2


К 96 см спиртового раствора йодистого калия массовой концентрацией 5 г/дм добавляют 2 см спиртового раствора основного фуксина [5] массовой концентрацией 50 г/дм и 2 см спиртового раствора йода массовой концентрацией 50 г/дм .


Йодистый калий растворяют в спирте на водяной бане при температуре (45±5) °С при постоянном помешивании.


4.2 Отбор и подготовка проб по ГОСТ 9225.




5 Порядок проведения контроля


5.1 Метод определения количества Staphylococcus aureus с предварительным обогащением


5.1.1 Подготовка и проведение контроля


5.1.1.1. Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений по ГОСТ 9225 так, чтобы можно было определить наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном документе на конкретный продукт.


5.1.1.2. Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см в пробирки или колбочки с солевым бульоном (3.2.4).


Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:10.


Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24 ч.


5.1.1.3 Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера (3.2.7), желточно-солевой агар или молочно-солевой агар (3.2.5; 3.2.6).


Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч.


5.1.1.4 После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.


На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2-4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.


На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2-4 мм, слегка выпуклых.


На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1-1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1-3 мм.