Страница 4: Методичні вказівки з мікробіологічної діагностики кашлюку та паракашлюку (45093)

Приготування напіврідкого агару КВА. Казеїново-вугільний агар готується за прописом, але агар-агару додають 1г на 1 дм3 середовища (0,1%), розливають у пробірки (у кількості до 8см3) і стерилізують при 0,5 атм. 20хв. У напіврідкий КВА можна додати стерильну дефібриновану кров великої рогатої худоби або коня з розрахунку 0,5-1 см3 на 8см3 середовища.

Культуру бордетели засівають у середовище, витримують у термостаті 3-4 дні, а потім без пересівання зберігають у холодильнику або при кімнатній температурі протягом 1міс.

При збереженні культури збудника кашлюку на щільному середовищі КВА її пересівають через 10-14днів.

14 Вимоги безпеки

Мікробіологічні дослідження з метою діагностики та профілактики кашлюкової інфекції проводять з дотриманням вимог біологічної безпеки відповідно до ДСП 9.9.5. -080 –2002 “Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю”

Характеристика мікробів роду Bordetella

* -позитивна реакція з’являється через 4 години.

Умовні позначення: “-“ - відсутність ознаки; “+”- наявність ознаки.

Схема бактеріологічного дослідження

1.Перша доба. Посів досліджуваного матеріалу на середовища КВА, Борде-Жангу і інкубація в термостаті при 35 - 37°С.

пеніцилін (цефалексин)

і посудина з водою

35-37°С

на 72год.

2. Четверта доба дослідження (через 72 години):

1) вивчення характеру колоній на середовищах вирощування з використанням стереоскопічного мікроскопа;

2) відсів колоній для отримання чистої культури мікроба;

3. При наявності великої кількості колоній на середовищі вирощування:

1) приготування мазків, забарвлення їх за Грамом, мікроскопія;

2) постановка реакції аглютинації на склі зі специфічними неадсорбованими кашлюковими та паракашлюковими сироватками в розведенні 1:10 і специфічними монорецепторними сироватками до аглютиногенів (факторів) 1 і 14;

3) постановка проби на уреазу.

4. Видача попереднього позитивного результату проведеного дослідження.

КВА КВА, Борде-Жангу

5. П’ятий-шостий день дослідження (через 96-120 годин). Вивчення виділеної чистої культури у випадку наявності в досліджуваному матеріалі паракашлюкового або бронхісептичного мікробів:

а) вивчення характеру росту чистої культури і зміни кольору поживного середовища; приготування мазків і забарвлення їх за Грамом, мікроскопія;

б) постановка реакції аглютинації на склі з видовими неадсорбованими і монорецепторними сироватками до аглютиногенів (факторів) 1, 14 і 12;

в) постановка проби на уреазу й облік результатів; посів на середовище МПА з тирозином; при необхідності визначення рухливості шляхом посіву в стовпчик напіврідкого агару; посів на середовище Сімонса.

г) облік результатів 4-х діб дослідження;

д) визначення сероваріанту збудника кашлюку;

є) видача остаточної відповіді: позитивної чи негативної.

6. При відсутності росту підозрілих колоній на третю добу дослідження чашки із середовищем вирощування переглядають на четверту і п’яту добу.

Подальший хід дослідження продовжується за схемою:

МПА МПА Сімонса н/р 0,3 % агар сечовина

з тирозином

Додаток №3

Методи приготування поживних середовищ

Загальні вимоги до виготовлення поживних середовищ викладені в ГОСТ 10444.1 - 84.

З метою підвищення достовірності та якості досліджень перевагу слід віддавати поживним середовищам та діагностичним препаратам промислового виробництва.

У випадку відсутності готових комерційних поживних середовищ, середовища готуються за пропонованою рецептурою.

Згідно сучасних вимог для приготування поживних середовищ замість дистильованої води використовують воду очищену.

Дату приготування та результати контролю якості поживних середовищ реєструють в “Журналі приготування та контролю поживних середовищ” (Ф№256/0)

1. Гідролізат казеїну

Для приготування гідролізату казеїну рекомендується використовувати казеїн кислотний технічний першого сорту, ГОСТ 1211-41 і харчовий кислотний ТУ 153-54; активоване деревне вугілля освітлююче марки А, ГОСТ 4453-48 (може бути використане активоване вугілля й іншої марки); соляну кислоту хімічно чисту з питомою вагою 1,19.

Казеїн відмивають 0,2% розчином оцтової кислоти протягом 6-7 днів (25см3 80% оцтової кислоти на 10дм3 води). Перший день розчин змінюють 3 рази, а наступні 5-6 днів по 1 разу на день. Потім казеїн промивають очищеною (дистильованою водою), добре відтискають і висушують при температурі від 60° до 70°С або при кімнатній температурі.

Гідролізат казеїну одержують під тиском за допомогою міцної соляної кислоти. Для цього в скляному посуді (колба або сулія ємністю 2 дм3) змішують казеїну, 400 см3 соляної кислоти і 200 см3 очищеної (дистильованої) води. Суміш автоклавують при 127°С протягом 3-4 годин. Після автоклавування гідролізат дворазово розводять очищеною (дистильованою) водою, фільтрують через полотнину або папір. Потім об’єм фільтрату доводять очищеною (дистильованою) водою до 3 дм3 і освітлюють активованим вугіллям. Для цього додають вугілля на 1дм3 фільтрату. Суміш кип’ятять протягом 10 хвилин і пропускають через паперовий фільтр. Із вказаної кількості казеїну виходить приблизно 3 дм3 гідролізату, що являє собою прозору рідину ледь жовтуватого кольору. Після фільтрації в готовому гідролізаті визначають кількість амінного азоту методом формольного титрування (методика кількісного визначення амінного азоту наводиться нижче). Гідролізат можна зберігати при кімнатній температурі при додаванні 0,5% хлороформу протягом декількох місяців.

2. Діалізат дріжджів

Свіжі хлібні дріжджі (пресовані) у кількості 1кг розмішують у 1дм3 очищеної (дистильованої) води до стану гомогенної маси, переливають у целофановий мішок, попередньо промитий очищеною (дистильованою) водою. Мішок зав’язують, обмивають під струменем водопровідної води, а потім очищеною (дистильованою) водою і занурюють в емальований посуд (каструля, бак), у яку попередньо налито 1,3 дм3 очищеної (дистильованої) води. Мішок повинен бути повністю занурений у воду. Діаліз ведуть при температурі 60 - 80°С протягом 6 годин (за цей час кількість води в каструлі повинна зменшитися приблизно в 2 рази). Потім рідину з каструлі переливають у стерильну сулію. Для підвищення виходу діалізату можна повторити діаліз цих же дріжджів у такий спосіб: мішок із дріжджами заливають другий раз такою ж кількістю очищеної (дистильованої) води, попередньо нагрітої до 70°С; посудину, у якій проводиться діаліз, з метою збереження тепла накривають ватником і залишають на ніч. Наступного дня рідину з каструлі змішують з першою порцією, додаючи хлороформ (0,5%), і зберігають при температурі 5 - 7°С до 3-х місяців.

3. Екстракт дріжджів

Свіжі хлібні дріжджі (пресовані) у кількості суспендують у 1дм3 дистильованої води, стерилізують текучою парою (100°С) протягом 30 хв., потім відстоюють у холодильнику (+4°С) протягом 3-6 діб. Надосадову рідину декантують (обережно зливають), розливають у флакони і знову стерилізують при 100°С протягом 30 хвилин. Зберігають дріжджовий екстракт у холодильнику.

4. Казеїново-вугільний агар

Для приготування 1дм3 середовища КВА необхідні наступні інгредієнти:

1) казеїновий гідролізат - з розрахунку, щоб у готовому середовищі містилося 30-150 мг% амінного азоту (розрахунок кількості гідролізату приводиться нижче);

2)КН2Р04 - 0,5г;

3)MgCl2 - 0,4г або 2 см3 20% розчину;

4)крохмаль розчинний -1,5г;

5) СaСl2 - або 1 см3 1% розчину;

6)FeS04 - або 1 см3 1% розчину;

7)CuS04 або 1 см3 0,5% розчину;

8) цистин або цистеїн - 0,03г чи 2cм3 1,5% розчину;

L і LD - форми

9) дріжджовий діалізат або дріжджовий екстракт – 100 см3;

10) агар-агар -22г;

11) вугілля активоване -Зг;

Кількість гідролізату казеїну, яку беруть для приготування казеїново-вугільного агару, не є постійною, а змінюється в залежності від вмісту амінного азоту. Кількість гідролізату, яку варто взяти для приготування середовища, визначають у такий спосіб: якщо, наприклад, у казеїновому гідролізаті міститься 800 мг% амінного азоту, а у виготовленому середовищі повинно міститися його 150 мг%, то роблять розрахунок:

(1000 см3 * 150 мг%) / 800 мг% ==187 см3 гідролізату на 1дм3 середовища.

Казеїновий гідролізат і дистильовану воду (приблизно 600 см3) змішують в емальованій каструлі відповідної ємкості і нейтралізують 20% їдким натром до рН 7,0 за бромтимоловим синім (до зеленого кольору). Потім вносять наважки різних солей за прописом. Крохмаль попередньо розчиняють у невеликій порції гарячої води і вносять у вигляді розчину. Агар-агар промивають під струменем водопровідної води протягом декількох годин або замочують на 1-2 години і вносять у суміш, після чого кип’ятять 10 хв. для розплавлення агар-агару. Потім до суміші додають цистин або цистеїн, дріжджовий діалізат або дріжджовий екстракт. Встановлюють рН 7,3 і вносять активоване вугілля, ретельно перемішуючи. Середовище розливають у флакони або пробірки. Стерилізують при 110°С протягом 20хв. Середовище у флаконах після стерилізації охолоджують до 45-50°С, ретельно перемішують для рівномірного розподілу вугілля і розливають у чашки, а середовище в пробірках після охолодження і перемішування, скошують. Середовище, що залишилося про запас, у флаконах (матрацах) у міру необхідності розтоплюють на водяній бані або апараті Коха (текучою парою) до повного розплавлення агару. Зайве прогрівання середовища не рекомендується. Готове середовище повинне мати чорний колір, конденсаційна вода не повинна містити часток вугілля. Середовище, розлите в чашки Петрі, зберігається в холодильнику протягом тижня.

Для поліпшення якості поживного середовища одночасно з цистіном можна додати проліну або глютаміну на 1 дм3 середовища.

5. Середовище із сухого казеїново-вугільного агару (КВА)

У 100 см3 очищеної (дистильованої) води ретельно розмішують 4,5- порошку, доводять до кипіння, автоклавують 30 хв. при 110°С. Середовище перемішують і розливають у чашки Петрі або пробірки. Повторне розтоплювання середовища не рекомендується.

Для поліпшення якості на 100 см3 стерильного охолодженого КВА додають 3-5 см3 стерильної дефібринованої крові барана, коня, великої рогатої худоби, кролика, людини. Середовище ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі або пробірки.

Замість крові для поліпшення росту можна додати, до автоклавування середовища, 0,5% активованого вугілля марки «А» або іншої марки одночасно з дріжджовим діалізатом або екстрактом (50см3 на 1дм3 середовища), попередньо нейтралізованим (за бромтимоловим синім до зеленого кольору) до рН 7,0.

6. Картопляно-гліцериновий агар (середовище Борде-Жангу),

(розрахунок на 4дм3 середовища)

Картоплю ретельно миють щіткою з милом, обтирають спиртом і знімають ножем поверхневий шар, ретельно вирізуючи всі бруньки. Промивають дистильованою водою, нарізають на шматки і зважують необхідну кількість у чистий посуд. Картоплю в кількості заливають 1дм3 дистильованої води, варять до неповної готовності, додають 4% гліцерину і варять до повної готовності. Рідину, що залишилася, фільтрують через 6 шарів марлі, попередньо промитої і висушеної. До картоплі, що залишилася в каструлі, додають невелику кількість гарячої дистильованої води, струшують, дають недовго відстоятися і фільтрують через той же фільтр, після чого доводять об’єм рідини до первісного (1дм3), додаючи гарячу воду (дистильовану) через той же фільтр. Картопляний відвар можна приготувати про запас, стерилізуючи при 120°С протягом 15хв.