Технічно більш простий спосіб приготування препаратів для темнопольної індикації борелій в переносниках запропонований чеськими дослідниками. Він полягає в наступному: заточеними препарувальними голками необхідно зробити 5-6 надрізів ідіосоми кліща, поміщеного на предметне скло в краплі фізрозчину (0,1 мл). При цьому вміст кишківника витікає сам або при легкому натисканні на нього в краплю, яку розподіляють по площі близько кв. і досліджують при невеликому збільшенні з застосуванням покривного скла. При мікроскопії матеріалу без застосування покривного скла помітно знижується повнота виявлення слабо інфікованих особин. Пошук борелій проводять тільки в доступній для перегляду найбільш тонкій крайовій частині краплі, в смузі, що за шириною не перевищує діаметр одного поля зору.
Цей метод настільки ж результативний для індикації борелій, як і дослідження середньої кишки кліщів, а виготовлення такого препарату займає набагато менше часу і дозволяє досліджувати до 40 кліщів за один робочий день.
Аналогічним чином можна проводити і дослідження німф. При цьому об'єм краплі фізіологічного розчину, в якій висікають кліща, повинен бути значно меншим (не більше 5 мкл).
Оцінка ступеня індивідуальної інфікованості кліщів B. burgdorferi шляхом мікроскопії фіксованих препаратів у світлому полі. Спрощений спосіб приготування фіксованих мазків полягає в тому, що від дорослого кліща, утримуючи його пінцетом, відрізають задній край тіла так, щоб не відсікти задні дивертикули кишківника. Потім, тримаючи кліща вертикально, проводять зрізом по поверхні предметного скла, роблячи мазки довжиною 2,5- із стінок і вмісту кишківника. Готові мазки висушують на повітрі і фіксують над полум'ям спиртівки. Мазки фарбують за Романовським-Гімза з дофарбовуванням 1% розчином кристалічного фіолетового впродовж 30 хв. Оскільки вицвітання препарату починається доволі швидко, його перегляд потрібно провести не пізніше, ніж через 2-3 тижні після приготування. До цього препарати потрібно зберігати в темноті. У разі вицвітання препарату можливе його повторне дофарбування кристалічним фіолетовим вказаним вище способом. Висушені препарати досліджують у світловому мікроскопі з масляною імерсією при загальному збільшенні х 700 (100 х 7). При перегляді препарату пошук борелій ведуть на тонких (не більше одного шару клітин) ділянках мазка. Концентрацію борелій в препараті оцінюють за кількістю мікробних клітин на не менше ніж 100 полях зору. Виконання цього об'єму роботи з високим ступенем ймовірності гарантує виявлення борелій в препараті із інфікованого кліща.
Для приготування препарату із німфи її роздушують будь-яким тонким інструментом з зашліфованим кінцем і залишками кліща проводять по предметному склу. Звичайно таким шляхом вдається зробити лише один мазок, котрий обробляють і досліджують, як описано вище.
Серологічна діагностика
Сьогодні в розвинутих країнах лабораторне обстеження хворих на ІКБ для виявлення специфічних антитіл проводиться в два етапи:
- перший етап - скринінг із застосуванням непрямої реакції імунофлюоресценсії (НРІФ) або імуноферментного аналізу (ІФА);
- другий етап - виключення хибнопозитивних результатів першого етапу досліджень і визначення специфічних антитіл до певних антигенів збудників методом імунного блотингу (Western-blot) (таблиця), рідше - визначенням ДНК збудника методом полімеразної ланцюгової реакції (PCR).
Поетапна серологічна діагностика ІКБ
|
|
|
|
|
|
Перший етап - якісна і кількісна оцінка наявності специфічнихантитіл (НРІФ, ІФА) |
|||
|
Результат позитивний |
Результат негативний |
||
|
Перехід до другогоетапу |
Закінчення дослідження (для остаточноговиключення ранньої стадії ІКБ - повторнедослідження по першому етапу через3-4 тижні після першого) |
||
|
Другий етап - визначення специфічності IgG або IgM до певнихбілків борелій (Western-blot) або підтвердження наявності ДНКзбудника в матеріалі від хворого (PCR) |
|||
|
Результат позитивний |
Результат невизначений |
Результат від'ємний |
|
|
Підтвердженнясерологічне діагнозу |
Повторне дослідженнячерез 1-2 тижніпісля першого (невиключений хибнийрезультат першогодослідження) |
Закінченнядослідження -хибний результатпершого етапу |
З урахуванням особливостей імунології ІКБ до початку 2 місяця серологічне дослідження приблизно в 50% випадків є неінформативним, тому важливо досліджувати сироватки з інтервалом в 20-30 днів. Для пізніх стадій ІКБ характерним є значне підвищення рівня антитіл (до 100%).
Важливо пам'ятати, що хибні позитивні серологічні реакції спостерігаються у хворих на сифіліс, поворотний тиф, інші спірохетози, а також при ревматичних захворюваннях і при інфекційному мононуклеозі. Хибні від'ємні результати можуть спостерігатися на ранній стадії інфекції (до 2-4-ого тижня захворювання) і значно рідше на пізніх стадіях, коли за рядом причин перестають вироблятися специфічні антитіла.
Непряма реакція імунофлюоресценції (НРІФ) була розроблена і запропонована в клінічну практику для діагностики ІКБ однією з перших. До сьогодні цей лабораторний тест широко використовується, в тому числі і в Україні, залишаючись найбільш дешевим і доступним для широкого кола медичних установ. При дотриманні певних прийомів оцінки одержаних результатів ця реакція дозволяє у більшості випадків успішно верифікувати ІКБ у звичайних умовах клініко-діагностичної лабораторії.
Для дослідження придатні: сироватка крові, ліквор, внутрісуглобова рідина. Використання полівалентних (проти всіх класів) або специфічних (проти певних класів) імуноглобулінів антисироваток, мічених ФІТЦ дозволяє визначати як загальну кількість специфічних антитіл, так і антитіл певних класів (IgM, IgG). Специфічність цієї реакції лежить в межах 96-98%. Такий рівень специфічності НРІФ дозволив визначити (в залежності від регіону) за діагностичний результат розведення сироватки 1:40-1:64 і вище (дані ЛНДІЕГ). За допомогою даного тесту досить важко оцінити ефективність проведеного лікування в перше півріччя, тому що навіть після елімінації збудника (3-6 місяців) титри специфічних антитіл зберігаються на попередньому рівні. Таким чином, при лабораторному обстеженні хворих методом НРІФ контроль якості проведеного лікування проводять у вищевказані терміни. При використанні НРІФ обов'язковим є обстеження парних сироваток з інтервалом 3-5 тижнів. Дослідження сироваток з інтервалом 12-14 днів підвищують ефективність реакції до 40,0%, з інтервалом 4-5 тижнів до 76,8-90,0%. Якщо перше звернення хворого відбулося пізніше - через 2-4 тижні після укусу кліща, термін між обстеженнями 1 і 2-ої сироваток може бути скорочений. Для лабораторного підтвердження діагнозу "Іксодовий кліщовий бореліоз" необхідним є не менше ніж чотирикратне зростання титрів антитіл в парних сироватках хворого, або таке ж зниження титрів після проведеного лікування.
Підготовка до постановки НРІФ: Приготування буферного розчину (ФБР) за Мак-Ілвейном ( фосфатний буфер, рН 7,2): гідрофосфату натрію двозаміщеного (чи гідрофосфату натрію однозаміщеного) і лимонної кислоти розчинити в дистильованої води; виміряти рН (7,2); до отриманого розчину додати хлориду натрію, розмішати і долити до 1000,0 мл дистильованою водою. Виміряти рН (7,2). Всі реагенти використовувати тільки "ХЧ".
Підготовка антигену до роботи. Нанести краплі суспензії антигену (об'ємом 0,015-0,02 мл) в кожну з лунок добре відмитого і знежиреного предметного скла і висушити при кімнатній температурі на чітко горизонтальній поверхні. Антиген на склах можна зберігати, уникаючи зволоження при 4-6 град. C до 6 міс.
Постановка НРІФ. Приготувати робоче розведення ФІТЦ-міченої сироватки проти імуноглобулінів людини на розчині альбуміну, міченого родаміном (відповідно до інструкції, що додається до цих препаратів). Приготувати двократні розведення досліджуваних сироваток на ФБР, починаючи з 1:8, а також робочі розведення позитивної і негативної контрольних сироваток. Перед постановкою реакції витримати скла з антигеном при кімнатній температурі 15-20 хв. Нанести 20 мкл кожного розведення у відповідну лунку з антигеном. Інкубувати у вологій камері при +37 град. C 30 хв. Відмити скла в ФБР протягом 10 хв. Висушити (не промокаючи). Нанести 20 мкл робочого розведення міченої сироватки в кожну лунку. Інкубувати, промити, як вказано вище. Мікроскопіювати в люмінесцентному мікроскопі типу "ЛЮМАМ" ("МЛД-1", "МЛД-2") у відбитому світлі, з водно-імерсійним об'єктивом х60, тубусом х1,1 і окуляром х10. Первинні світлофільтри: ФС-1-4; СЗС-21-2; ФС-1-6; окулярний - зелений.
---------------
* Для постановки реакції використовують корпускулярний антиген B. burgdorferi, який готують з культури штаму-продуцента антигену в лабораторії переносників інфекцій НДІЕМ ім. М.Ф. Гамалеї РАМН (Москва), люмінесціюючі сироватки проти глобуліну людини (полівалентні, анти-M і анти-G) і бичачий альбумін, мічений родаміном, що виготовляються в тому ж інституті. Адреса: 123098, Москва, вул. Гамалеї, 18.
При перегляді препаратів оцінку результатів проводять на основі яскравості і тону світіння мікробних клітин антигену. Чітко виражена зелена флюоресценсія більшості ізольовано розташованих мікробних клітин розцінюється як позитивний результат. Найбільше розведення досліджуваної сироватки, при котрому спостерігається позитивний результат, оцінюється як її титр.
Імуноферментний аналіз (ІФА). Використання для ІФА очищених антигенів борелій, а також рекомбінантних антигенів забезпечує високу ступінь специфічності тесту. ІФА має деякі переваги перед НРІФ, які полягають в більшому рівні його чутливості, особливо на другому - третьому тижні захворювання. Разом з тим, слід відмітити, що ІФА, виграючи за чутливістю у НРІФ, залишається на одному рівні або навіть поступається останній у специфічності. Таким чином, на даному етапі досліджень саме ці реакції (НРІФ і ІФА) є методами вибору для першого етапу покрокової серологічної діагностики ІКБ.
Постановка реакції здійснюється згідно з інструкцією виробника тест-систем. Антиген вносять в лунки мікропланшетів і висушують, після чого в лунки послідовно (з проміжним відмиванням) вносять досліджувані сироватки в робочих розведеннях, контрольні сироватки, кон'юговані з ферментом антивидові антитіла і проявник. При цьому результати реакції зчитуються візуально або, у відповідності до зміни оптичної щільності проби, визначають їх спеціальним приладом (ридером). Найчастіше для постановки ІФА використовують тест-системи "Dako" (Данія) і НПФ "Хелікс" (НДІЕМ ім. Пастера, Санкт-Петербург, Росія), "Enzygnost, Dade Behring" (Німеччина). Реакція може використовуватись в лабораторіях, що забезпечені відповідним обладнанням.
Метод імунного блотингу (Western-blot) заснований на взаємодії специфічних антитіл з електрофоретично розділеними фракціями антигенів. Метод Western-blot володіє високою чутливістю і специфічністю. Перевага методу полягає у виявленні специфічних антитіл до певних антигенів збудника, тобто можна одержати точну відповідь про участь окремих антигенів в формуванні імунної відповіді на конкретній стадії інфекційного процесу.
Підготовка тестової смужки. Електрофорез антигенного матеріалу певного мікроорганізму або вірусу призводить до розділення антигенних компонентів за молекулярною вагою. Потім методом імуноблотінгу (аналог витискання на "промокашку" надлишку чорнил) антигени переносять на смужку нітроцелюлози, яка відтепер містить невидимий поки оком спектр антигенних смужок, характерний для певного мікроорганізму.
Дослідження проби. На нітроцелюлозну смужку наносять досліджуваний матеріал (сироватка пацієнта і т. ін.) і, якщо в пробі є специфічні антитіла, то вони зв'язуються із точно відповідними їм (компліментарними) антигенними смужками. Результат цієї взаємодії віалізується, тобто стає видимим.
Трактовка результату. Наявність смужок і на певних ділянках нітроцелюлозної пластини підтверджує наявність в досліджуваній сироватці антитіл до точно визначених антигенів.
Метод непрямої реакції імунофлюоресценції (НРІФ). Тривала процедура розтину кожного кліща і видобування з нього кишківника обмежує масове обстеження кліщів на наявність борелій. Тому для виявлення природних вогнищ ІКБ при скринінгових обстеженнях кліщів на наявність борелій ЛНДІЕГ пропонує непряму реакцію імунофлюоресценції, яку успішно використовує для серологічної діагностики кліщових бореліозів у хворих.
При застосуванні НРІФ для детекції борелій використовується готовий безкоштовний антиген - гемолімфа досліджуваних кліщів і не менш доступний антитільний препарат - позитивна сироватка хворих на ІКБ з високими (не менше 1:64) титрами специфічних антитіл.
Гемолімфу з кліщів, на відміну від описаного методу відрізання (висікання) заднього краю тіла кліща, одержують відсікаючи одну з кінцівок кліща вище вертлугу. Такий спосіб дозволяє одержувати чисту прозору гемолімфу. На лунку добре відмитого і знежиреного предметного скла, спеціально призначеного для постановки нРІФ, наноситься крапля отриманої гемолімфи кліща і висушується при кімнатній температурі на чітко горизонтальній поверхні. Такий антиген на склах можна зберігати, уникаючи зволоження, при 4-6 град. С до 1 міс. На кожну лунку з антигеном наносять по краплі (25 мкл) високоактивної сироватки крові хворого (в робочому розведенні). Подальшу постановку реакції і облік результатів здійснюють, як описано вище.
Зважаючи на те, що серед заражених переносників, як правило, переважають слабо інфіковані особини, то при виявленні спірохет методом НРІФ слід переглянути не менше 50 полів зору в кожному препараті.
Метод полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) - молекулярно-біологічний метод, що виявляє наявність специфічних ділянок ДНК і РНК, що становить циклічний процес збільшення в геометричній прогресії кількості копій обмеженого синтетичними олігонуклеотидами (праймерами) визначеного (певного) фрагменту ДНК, який перебігає під дією термостабільної ДНК-полімерази, за умови чітко заданих температурних і часових режимів. Для діагностики бореліозів в даний час не уніфікований, для одержання більшої ймовірності результатів ПЛР бажано використання кількох діагностичних ПЛР-систем. В клінічній діагностиці ІКБ метод ПЛР використовують для визначення ДНК борелій в різному біологічному матеріалі: шкірному біоптаті, крові, сечі, цереброспінальній та суглобовій рідинах і ін., кліщах. Висока чутливість цього методу дозволяє визначити інфікованість пацієнта на 7-14 день від моменту присмоктування кліща. Метод ПЛР дозволяє встановити присутність декількох поодиноких молекул ДНК і РНК мікроорганізму в біологічному зразку. Крім того, ПЛР дозволяє ідентифікувати збудник до геновиду, здійснювати діагностику бореліозних мікст-інфекцій, виявляти випадки повторних інфікувань і проводити контроль ефективності терапії за елімінацією збудника і стосовно різних геновидів борелій.
