При використанні комерційних антигенів дослід шахового титрування виконують одночасно в двох-трьох варіантах з усіма дозами комплементу, що запропоновані інструкцією.
Одиницею антигену, або його титром, вважають його найбільше розведення, що дало повне або майже повне зв'язування комплементу з найбільшим розведенням сироватки. Специфічний діагностикум придатний для використання, якщо його титр не нижчий за вказаний в інструкції (вимога придатності антигену при проведені переконтролю).
3. Антикомплементарні властивості деяких сироваток перешкоджають їх дослідженню. Природа антикомплементарних властивостей різна. У одних людей сироватка антикомплементарна завжди, у інших ця властивість з'являється періодично. Сироватки, що позбавлені цих властивостей, можуть їх набути внаслідок бактеріальної контамінації або хімічного забруднення, в тому числі і продуктами гемолізу еритроцитів.
Для звільнення сироватки від антикомплементарних властивостей запропоновані наступні методи: а) інактивація 20 хвилин при +65 град. C (замість +60 град. C); б) інактивація 20 хвилин при +60 град. C, яка проводиться два дні поспіль; в) додавання комплементу - на 4 об'єми нерозведеної сироватки додається 1 об'єм нерозведеного комплементу, суміш витримують протягом ночі при +4 град. C, потім прогрівають 30 хвилин на водяній бані при +37 град. C, додають фізіологічний розчин до розведення сироватки 1:4 або 1:8 (до початкового розведення для РЗК) і прогрівають 30 хвилин при +60 град. C. Всі ці методи можуть дещо знижувати специфічний титр, тому необхідно аналогічним чином обробляти всі зразки цього хворого, незалежно від наявності чи відсутності антикомплементарних властивостей його сироватки; г) сироватки, що одержані з дуже гемолізованих зразків, стають придатними для дослідження тільки після адсорбції гамаглобуліна на іонообмінниках Сефадекс СМ-75 або СМ-100.
Імунноферментний аналіз (ІФА)
Метод заснований на принципі сорбції білків на твердій фазі з наступним утворенням комплексів антиген - антитіло, що виявляється субстратіндикаторним розчином. В комерційних тест-системах в лунках планшет міститься специфічний вірусний імуноглобулін (або його вносять самостійно). Антиген, що додається в лунки мікропланшети, специфічно зв'язується з антитілами. На шар антигену наноситься досліджувана сироватка людей в потрібних розведеннях. При наявності в сироватці специфічних антитіл останні зв'язуються з антигеном. Для виявлення зв'язування на шар антитіл наноситься імуноглобулін проти глобулінів сироватки людини, який кон'югований з пероксидазою хрону. Кількість сорбуючого кон'югату пропорційна кількості антитіл сироватки людини, що зв'язалися з антигеном. Цю кількість можна визначити за ступенем забарвлення, використовуючи субстратіндикаторний розчин (ортофенілендіамін + + перексид водню), компоненти якого внаслідок дії пероксидази кон'югату забарвлюють розчин в брунатно-жовтий колір.
Оцінка результатів серологічної діагностики
Серологічний діагноз заснований на визначені специфічних антитіл у діагностичному титрі або його зростанні (чотирьохразовому і вище).
У таких випадках клінічний діагноз вважають достовірно підтвердженим. Стабільний титр антитіл у всіх зразках крові хворого, які забирали в різні строки від початку хвороби, не є вірогідним свідоцтвом для підтвердження або спростування клінічного діагнозу, оскільки в крові мешканців ендемічних областей можуть бути виявлені специфічні антитіла, що сформувалися в процесі природньої імунізації, або вакцинації. Негативний результат дослідження зразків крові протягом не менше 2 місяців від початку захворювання виключає діагноз кліщового енцефаліту.
При оцінці результатів серологічного дослідження необхідно враховувати: термін обстеження хворого від початку захворювання, особливості клінічного перебігу хвороби, можливість наявності у хворого специфічного імунітету, що сформувався в процесі природної або штучної (вакцинація, введення специфічного гамаглобуліну) імунізації, який виявився з тих чи інших причин недостатньо напруженим, введення з лікувальною метою лікарських препаратів, що впливають на функцію імунної системи. При пізньому початку обстеження титр антитіл в першому зразку крові може бути найвищим. Внаслідок цього показники дослідження парних сироваток будуть однаковими. Такі ж показники можна одержати при обстеженні крові хворих, вакцинованих до початку захворювання або імунізованих природним шляхом, - титр антитіл у них дуже швидко сягає максимальних величин. Виявлення специфічних антитіл у першому зразку крові може бути обумовлено пасивним імунітетом, якщо незадовго до забору крові хворому вводили специфічний гамаглобулін високого титру. Уповільнення формування гуморального імунітету відмічають при важких формах захворювання, двохвильовому перебігу КВЕ, при пригніченні функції імунної системи деякими лікарськими препаратами, при введенні гамаглобуліну з профілактичною або лікувальною метою, а також у випадках послаблення загального стану організму попередніми або хронічними захворюваннями.
Найбільш чутливим методом виявлення специфічних антитіл є ІФА, проте, в практиці серологічне обстеження починають з РГГА. Цей метод є достатньо чутливий і простий. Показники, що свідчать про діагностичне зростання напруженості імунітету, дають можливість закінчити дослідження на цьому етапі і направити до лікувального закладу результат про достовірне підтвердження клінічного діагнозу. При відсутності діагностичного зростання титрів антитіл в РГГА проводять додаткове дослідження, парних сироваток в РЗК з огляду на більш пізнє формування комплементзв'язуючих антитіл.
Відсутність специфічних антитіл в I і II зразках крові при наявності клініко-епідеміологічних показників вказує на доцільність дослідження 3-го зразка, взятого через 2 місяці від початку захворювання або 1-1,5 місяці після зникнення симптомів захворювання. При відсутності антитіл у цей період діагноз вважають непідтвердженим.
Використання ІФА як основного методу дослідження крові хворого або для обстеження невиразних, за даними РГГА і РЗК, випадків дозволяє підвищити вірогідність лабораторної діагностики КВЕ внаслідок більшої чутливості цього методу. Для додаткового серологічного обстеження матеріалів від хворих при наявності необхідних інгредієнтів і навичок можна використовувати ряд інших методів: реакцію нейтралізації, дифузної преципітації в агарі (РДПА), непрямої гемаглютинації (РНГА), радіального гемолізу в гелі (РРГ), метод виявлення в РГГА специфічних антитіл класу М за допомогою обробки сироваток 2-меркаптоетанолом або усунення імуноглобулінів G стафілококовим реагентом. При цьому необхідно використовувати відповідні методичні вказівки і рекомендації, затверджені Міністерством охорони здоров'я України. ("Методические рекомендации по эпидемиологии, клинике, лабораторной диагностике и профилактике арбовирусных заболеваний", Львов -1997).
Суттєву допомогу в постановці діагнозу КВЕ може надати дослідження специфічного клітинного імунітету. З цією метою використовують метод гальмування міграції лімфоцитів.
Необхідно пам'ятати, що при серологічній діагностиці КВЕ обов'язковою умовою є дослідження парних сироваток в одному досліді. Забороняється аналізувати результати дослідження окремих зразків із різних дослідів. У зв'язку з цим всі зразки крові хворого зберігають декілька місяців до кінця періоду дослідження.
При дослідженні сироваток хворих необхідно дотримуватися правил, що встановлені для роботи із потенційно інфікованим матеріалом. Зазначені серологічні методи застосовуються також для вивчення імунного прошарку населення та тварин в природних вогнищах і для дослідження імунітету у осіб, вакцинованих проти КВЕ.
Вірусологічна діагностика
Приготування матеріалу для вірусологічного дослідження. В якості матеріалу для зараження (інокуляту) використовують суспензії, що готують із згустку крові або гепаринізованої крові, сироватку, плазму і спинномозкову рідину хворих. Щоб запобігти автоінтерферуючій дії вірусу та токсичному ефекту інокуляту сироватку, плазму крові і спинномозкову рідину розводять фізіологічним розчином 1:10, 1:50. 3 мозку людей, що померли від кліщового вірусного енцефаліту, після подрібнення його в стерильних фарфорових ступках готують 10% суспензії на фізіологічному розчині, на розчині Хенкса або поживному середовищі для культури клітин (pH 7,0-7,2). До фізіологічного розчину та розчинів, на яких готують суспензії, в якості стабілізатора вірусу додають бичачий альбумін (0,75 %) або інактивовані прогріванням і перевірені на відсутність специфічних антитіл сироватки великої рогатої худоби, ембріонів корів, коней або кролів до 30%. Одержані суспензії перед інокуляцією освітлюють центрифугуванням при 1500-2000 об/хв. 10-15 хвилин. Для зараження культур клітин використовують надосадну рідину. Залишки суспензії зберігають для реізоляції агентів при температурі не вище -20 град. C.
В такий же спосіб досліджують кліщів, кров і органи тварин з метою виділення вірусу. Для проведення вірусологічного дослідження кліщів необхідно також керуватися методичними рекомендаціями "Вирусологические исследования отдельных экземпляров иксодовых клещей методом микроанализа", що затверджені Головним санітарно-епідеміологічним управлінням Міністерства охорони здоров'я СРСР 11.08.86 р. № 4135-86.
Матеріал для вірусологічного дослідження в культурах клітин і на тваринах повинні бути стерильними. Для дотримання цієї умови необхідно: а) забруднені матеріали обробити антибіотиками (пеніцилін - 1000 одиниць і стрептоміцин - 500 одиниць на 1 мл); б) у розчини, що використовують для приготування суспензій, додати антибіотики у вказаній концентрації; кліщів перед розтиранням в ступці відмити спиртом або ефіром, а потім стерильним фізіологічним розчином з антибіотиками.
Вибір методу виділення вірусу. Для виділення збудника КВЕ найбільш придатними з культур клітин є перещеплювані культури СНЕВ, а найчутливішими з лабораторних тварин - білі миші віком 1-3 доби. Дещо менше чутлива до вірусу КВЕ культура клітин курячого ембріону, проте при відсутності клітин СНЕВ і новонароджених білих мишей її також можна використовувати для зазначеної мети.
Надійніше виділяти вірус паралельним зараженням досліджуваним матеріалом клітин СНЕВ (2 пасажі) і білих мишей, однак на практиці найчастіше доводиться обмежуватися одним з цих способів.
У випадку виділення вірусу в культурі клітин ідентифікацію (а при використанні культур клітин курячого ембріону - і індикацію) виділеного агенту проводять за методом флюоресціюючих антитіл на другому пасажі досліджуваного матеріалу.
При необхідності тривалого зберігання вірусу, культуральною рідиною, що містить вірус, заражають молодих білих мишей вагою 6-. Мозок мишей, що захворіли, зберігають при температурі не вище -20 град. C.
Зараження білих мишей. Досліджуваний інокулят безпосередньо після приготування вводять новонародженим білим мишам в мозок в об'ємі 0,01-0,02 мл. Кожним зразком заражають 6-8 тварин (1 сім'ю). Термін спостереження - 21 день. Мозок мишей, що захворіли і загинули через 3 і більше днів після зараження, використовують для наступних пасажів.
Зараження культур клітин. Кожним зразком заражають по 2-4 пробірки з моношаром, використовуючи по 0,1 мл інокуляту на пробірку. Адсорбцію вірусу на клітинах проводять впродовж 1 години при кімнатній температурі або 30 хвилин при +37 град. C, після чого в пробірки додають середовище підтримки (середовище 199 на розчині Ерла, pH 7,6) з 3% прогрітої при +56 град. C (інактивованої) бичачої сироватки. В залежності від кількості вірусу в інокуляті накопичення його в культурі клітин сягає максимуму через 3-6 діб інкубації. На третю добу проводять другий пасаж досліджуваного матеріалу, за яким спостерігають протягом 7 днів.
Репродукція вірусу КВЕ в клітинах СНЕВ спричинює руйнування клітин, що обумовлено цитопатичною дією вірусу. Спостереження за інфікованими культурами проводять до появи неспецифічної дегенерації клітин в контрольних пробірках. В клітинах інших видів вірус КВЕ репродукується без ознак регулярної цитопатичної дії. В сумнівних випадках для виявлення вірусу необхідно провести додаткові пасажі.
Індикація і ідентифікація виділеного вірусу КВЕ. В культурі клітин СНЕВ вірус КВЕ виявляють за характерною цитопатичною дією, після чого ідентифікують прямим або непрямим методом флюоресціюючих антитіл. В культурі клітин курячого ембріону методом флюоресціюючих антитіл здійснюють як ідентифікацію, так і індикацію вірусу.
Вірус КВЕ у найбільшій концентрації накопичується в головному мозку новонароджених, а також молодих мишей масою 6-. Тому, у випадку виділення вірусу на мишах, з мозку тварин, що захворіли на II-III пасажах вірусу, готують антиген, який використовують для подальшої ідентифікації.
Прямий і непрямий методи флюоресціюючих антитіл дозволяють здійснити експрес-індикацію вірусу КВЕ в інфікованих культурах клітин. В першому випадку клітини, зафіксовані в ацетоні, обробляють гамаглобуліновою фракцією міченої ізотіоцианатом флюоресцеїну (ФІТЦ) імунної сироватки до вірусу КВЕ, в другому - специфічною імунною сироваткою, яка містить антитіла до вірусу КВЕ, і потім відповідною антивидовою сироваткою, що мічена ФІТЦ. Мічені комерційні антивидові сироватки доступні для придбання.
Модифікація методу. Матеріалом, що містить вірус в розведенні 1:10-1:50, заражають культури клітин СНЕВ або курячих ембріонів, які вирощені на покривних скельцях, в пробірках або пеніцилінових флаконах. Виявлення вірусного антигену проводять на 2 добу 2-го пасажу. Для цього пінцетом виймають 4-6 покривних скелець із пробірок з зараженою і контрольною культурою, промивають їх фізіологічним розчином, висушують і фіксують охолодженим ацетоном впродовж 15 хвилин. Потім на клітини наносять по краплі розведеної 1:10 імунної асцитної рідини або сироватки, що містить антитіла до вірусу КВЕ, після чого препарати інкубують у вологій камері при +37 град. C протягом 1 години. Після ретельного відмивання препаратів фізіологічним розчином від надлишку сироватки їх висушують, на клітини наносять суміш 1:1 відповідного антивидового гама-глобуліну (проти глобулінів миші, іншої лабораторної тварини або людини), міченого ФІТЦ, і бичачого альбуміну, міченого родаміном сульфафторидом, в робочих розведеннях, зазначених на етикетках. Родамін сульфафторид використовують для забарвлення нормальних клітин з метою контрастування специфічного світіння ФІТЦ, зв'язаного з антигеном вірусу. Препарати знову інкубують у вологій камері (+37 град. C, 30 хвилин), відмивають фізіологічним розчином і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. В цитоплазмі клітин, що мають антиген вірусу КВЕ, виявляється характерне яскраво-зелене світіння.
