При крапельному способі постановки РАР в ряд спеціальних пробірок місткістю 0,8-1,0 мл пастерівською піпеткою дають фізіологічний розчин: в першу - 4 краплі, в решту по 3 краплі. Потім в першу пробірку додають 1 краплю сироватки, старанно перемішують, одержуючи розведення 1:5. Шляхом переносу по 3 краплі розведеної сироватки з першої пробірки - в другу, з другої - в третю і так далі - до шостої одержують ряд розведень сироватки в об'ємі 3 крапель (в першій пробірці в об'ємі 2 крапель).
До сироватки в різних розведеннях додають по 3 краплі антигена (в першу пробірку - 2 краплі), одержуючи розведення сироватки ще в 2 рази: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320.
Для контролю сироватки роблять розведення її фізіологічним розчином 1:10. Для контролю антигена до 3 крапель фізіологічного розчину додають 3 краплі препарату. Штатив з рядом пробірок струшують для змішування реагентів і поміщають в термостат (37 град. С) на 18-22 години. Після термостата пробірки видержують 2-3 години при кімнатній температурі, не струшуючи їх, щоб не зруйнувати ніжний аглютинат рикетсій на дні пробірок. Реакцію читають без аглютиноскопа. При позитивній реакції на дні пробірки утворюється темно-коричневий осад у вигляді перевернутої парасольки. Характер аглютинації рикетсій дрібнозернистий.
Облік результатів. Ступінь аглютинації рикетсій оцінюють по трьохплюсовій шкалі:
- повне просвітлення надосадової рідини і чіткий осад на дні пробірки позначають трьома плюсами (3+);
- неповне просвітлення надосадової рідини при наявності чіткого осаду позначають двома плюсами (2+);
- незначне просвітлення надосадової рідини і слабовиражений осад оцінюють одним плюсом (1+).
При визначенні титру реакції враховують результати на три і на два плюси.
Облік результатів при постановці реакції об'ємним способом проводять таким самим чином; на дні пробірки спостерігається безколірний аглютинат.
1.4. Метод флуоресціюючих антитіл
Метод флуоресціюючих антитіл (МФА) відноситься до експресних методів діагностики. Він поєднує в собі високу специфічність імунологічного та високу чутливість люмінесцентного методів. Стосовно рикетсійних інфекцій використовують МФА для ідентифікації специфічних антигенів і антитіл. В практичних умовах застосовують прямий і непрямий МФА з диференціюючими кон'югатами на основі специфічних імуноглобулінів (сироваток).
Для діагностики рикетсійних захворювань на основі виявлення специфічних антитіл в крові хворих і перехворілих людей (або тварин) необхідно використовувати непрямий метод флуоресціюючих антитіл (нМФА). Для індикації збудника (антигена) можуть бути використані як прямий, так і непрямий варіанти МФА. Цей метод діагностики більш складний порівняно з пробірочними серологічними тестами, потребує використання спеціальних інгредієнтів і обладнання, в тому числі люмінесцентного мікроскопа, та відповідного досвіду роботи. Однак, враховуючи універсальність методу, можливість швидкого (протягом 1-2 годин) виявлення і серологічної ідентифікації антигенів або антитіл, в тому числі з диференціацією класів імуноглобулінів, МФА має бути застосований в повсякденній роботі практичних лабораторій, в першу чергу лабораторій відділів ОНІ обл (міськ) санепідстанцій.
Інгредієнти і обладнання, необхідні для постановки МФА
- Рикетсійні корпускулярні антигени або готові слайди антигенів на предметних скельцях.
- Специфічні імунні сироватки проти рикетсій (людини і лабораторних тварин).
- Люмінесціюючі специфічні сироватки проти рикетсій, мічені флуоресцеїн-5-ізотіоціанатом (ФІТЦ).
- Люмінесціюючі антивидові сироватки проти імуноглобулінів людини та різних тварин, мічені ФІТЦ.
- Бичачий альбумін, мічений родаміном.
- Забуферений фізіологічний розчин рН 7,2-7,4.
- Спирт 96%.
- Ацетон.
- Етиловий ефір (суміш Нікіфорова).
- Дистильована вода.
- Люмінесцентний мікроскоп.
- Предметні скельця, чашки Петрі, фільтрувальний папір.
Для приготування забуференого фізіологічного розчину в ізотонічного розчину хлориду натрію розчиняють двозаміщеного фосфорнокислого натрію і однозаміщеного фосфорнокислого калію.
1.4.1. Прямий метод флуоресціюючих антитіл. Фарбування препаратів та облік результатів проводиться відповідно настанови до люмінесціюючої специфічної (антивидових) сироваток проти рикетсій мічених флуоресцеїн-5-ізотіоціанатом (ФІТЦ).
1.4.2. Непрямий метод флуоресціюючих антитіл. Непрямий метод флуоресціюючих антитіл (нМФА) використовують з метою виявлення специфічних антитіл у хворих на рикетсіози людей і тварин та перехворілих. Одночасно можна проводити диференціацію класів імуноглобулінів, тому нМФА може застосовуватись для діагностики свіжих і анамнестичних антитіл.
Етапи проведення нМФА:
1-й етап. Підготовка антигена. Для нМФА використовують корпускулярні антигени рикетсій. В ампулу з сухим антигеном за день до приготування додають 1 мл дистильованої води з метою насичення корпускул рикетсій вологою. Наступного дня з цього основного розведення готують робоче розведення в фізіологічному розчині, щоб в мазку з такого розведення антигена виявлялось орієнтовно 100-200 рикетсійних корпускул в полі зору мікроскопа; мазки досліджують в прямому методі флуоресціюючих антитіл.
На предметні скельця, старанно вимиті та знежирені в суміші Нікіфорова, наносять невеликі краплі антигена у відповідному робочому розведенні. На кожне скло наносять 8 крапель. Такої кількості крапель достатньо для дослідження 1-2 сироваток. Мазки добре висушують на повітрі, фіксують протягом 20 хвилин спиртом або ацетоном і зберігають до використання при температурі від 0 до 4 град. С. Препарати необхідно оберігати від вологи. Такі мазки придатні для роботи протягом місяця.
Перед використанням антигенних слайдів кожну пляму антигена обводять восковим олівцем, щоб створити орієнтир для мікроскопування і бар'єр-перепону розтіканню досліджуваної сироватки та флуоресціюючого антивидового кон'югата.
2-й етап. Створення системи специфічного комплексу антиген + антитіло з досліджуваною сироваткою. Досліджувані сироватки, попередньо інактивовані протягом 30 хв. при температурі 56 град. С, розводять у фізіологічному розчині дворазово - від 1:10 до 1:80, а при необхідності і більше.
Краплі із відповідних розведень сироватки наносять піпеткою Пастера у зворотному напрямку на плями антигена і витримують 45 хвилин у зволоженій камері (чашка Петрі із зволоженим дном) в термостаті при 37 град. С. Потім препарат промивають фосфатним буферним розчином (РН 7,2-7,4) протягом 10 хвилин і висушують на повітрі. При наявності антитіл в досліджуваній сироватці утворюється специфічний комплекс антиген + антитіло.
3-й етап. Ідентифікація специфічного комплексу флуоресціюючим кон'югатом. Після висушування на мазки наносять по краплі антивидовий (відповідно досліджуваній сироватці) люмінесціюючий імуноглобулін (сироватку) в робочому розведені (згідно даних на етикетці ампули). Мазки знову витримують у зволоженій камері 30 хвилин при температурі 37 град. С.
В якості антивидових кон'югатів використовують люмінесціюючі сироватки проти гамаглобулінів людини, кроля, морської свинки, барана та інші - відповідно до видової належності досліджуваних сироваток. Для гасіння неспецифічного свічення необхідно застосовувати бичачий альбумін, мічений родаміном, або 0,1%-й розчин Еванса, які змішують з антивидовою люмінесціюючою сироваткою в рівних об'ємах з розрахунком, щоб при змішуванні мати робочі дози інгредієнтів.
Після інкубації препарати промивають в двох порціях фосфатного буферного розчину протягом 10 хвилин, споліскують дистильованою водою і висушують на повітрі.
Для контролю в кожний дослід вводять пробу з позитивною і негативною сироватками, а також контроль антивидової люмінесціюючої сироватки, в якому на пляму антигена наносять тільки флуоресціюючий кон'югат.
Облік результатів реакції. Препарати досліджують в люмінесцентному мікроскопі: об'єктив 90х, окуляр 10х або 7х. Використовують фільтри для препаратів, оброблених кон'югатами флуоресцеїн-5-ізотіоціаната (ФІТЦ): первинні світлофільтри для МЛ-2: ФС 1-4; СЗС 7-2; БС 8-2; окулярний - зелений; для ЛЮМАМ: ФС 1-4; СЗС 21-2; ФС 1-6; окулярний зелений.
Проглядають не менше 10-20 полів зору. Оцінку результатів реакції проводять відповідно до яскравості флуоресценції рикетсійних корпускул і їх морфології, використовуючи умовну шкалу визначення за допомогою плюсів:
4+ - яскрава, виблискуюча флуоресценція;
3+ - виразна, яскрава флуоресценція з характерним зеленим забарвленням; морфологія рикетсій виявляється чітко, у окремо відділених корпускул проявляються чіткі ободки за рахунок більш яскравого свічення комплексу антитіл з поверхневим антигеном;
2+ - флуоресценція слабка, морфологія клітин і колір люмінесценції виявляється досить чітко;
1+ - флуоресценція дуже слабка, морфологія рикетсій розрізняється погано, колір не визначений;
- - флуоресценція відсутня
За титр сироватки приймають максимальне її розведення, котре обумовлює свічення рикетсій на "2+" при наявності свічення "3+" або "4+" в попередньому розведенні.
Достовірною вважається реакція при відсутності свічення рикетсій в мазку антигена, обробленому лише флуоресціюючою антивидовою сироваткою в робочому розведенні, а також при відповідних результатах з позитивною і негативною сироватками.
2. Індикація та ідентифікація збудників рикетсійних захворювань
Методи діагностики збудників передбачають індикацію та ідентифікацію патогенних рикетсій у біологічних субстратах від хворої людини або тварин, а також в переносниках, органах дрібних ссавців, заражених експериментальних тварин та об'єктах довкілля.
Класичні методи виявлення та ідентифікації збудників рикетсійних захворювань шляхом зараження лабораторних тварин (морських свинок, білих мишей), курячих ембріонів, лабораторних культур вошей дефібринованою кров'ю або суспензією із згустків крові хворого, внутрішніх органів диких тварин, переносників (вошей, кліщів) та інших є високо специфічними і чутливими. Через значну трудомісткість та необхідність наявності спеціальних умов для роботи з рикетсіями II групи патогенності біологічні проби не можуть бути застосовані в практичних лабораторіях.
На місцях необхідно використовувати експресні методи діагностики збудників рикетсійних захворювань: метод флуоресціюючих антитіл (прямий і непрямий варіанти), реакцію непрямої гемаглютинації з імуноглобуліновим еритроцитарним діагностикумом та модифікацію РНГА з антигенним еритроцитарним діагностикумом - реакцію нейтралізації антитіл (РНАТ). При проведенні діагностичних досліджень біологічного матеріалу в експресних методах доцільно, по можливості, використовувати одночасно прямий або непрямий варіант МФА та один із варіантів РНГА.
2.1. Метод флуоресціюючих антитіл
Метод флуоресціюючих антитіл (МФА) використовують для виявлення рикетсійних антигенів в біологічних субстратах і об'єктах оточуючого середовища. Можна досліджувати: мазки крові (краще з суспензії згустку крові), мазки-відбитки внутрішніх органів дрібних ссавців, плаценти тварин, мазки з кишківників вошей, кліщів або суспензії з них та інші.
Порядок постановки МФА такий. На старанно вимитому та знежиреному предметному склі роблять тонкі мазки або відбитки досліджуваного матеріалу. Після висихання мазки фіксують етиловим спиртом або ацетоном протягом 30 хвилин. На мазку синім восковим олівцем роблять кола (залежно від кількості досліджуваних антигенів) діаметром , щоб створити перепону розтіканню люмінесціюючої сироватки.
В прямому варіанті МФА на відзначені олівцем поля фіксованих і висушених мазків наносять по краплі розведених люмінесціюючих сироваток проти пошукуваних антигенів рикетсій. Розведені сироватки попередньо змішують в рівних об'ємах з бичачим альбуміном, міченим родаміном, з розрахунку, щоб в суміші інгредієнти були в робочому розведенні, вказаному на етикетках ампул. Бичачий альбумін, мічений родаміном, застосовують для гасіння неспецифічного свічення.
На одне (контрольне) поле мазка наносять гетерологічну люмінесціюючу сироватку в суміші з бичачим альбуміном. Мазки у зволоженій камері (чашці Петрі), для попередження висихання кон'югата, поміщають на 30 хвилин у термостат (37 град. С). Після інкубації мазки промивають протягом 10 хвилин у фосфатному буферному розчині (РН 7,2-7,4) для видалення залишків флуоресціюючих сироваток. Після споліскування дистильованою водою препарати висушують на повітрі і досліджують в люмінесцентному мікроскопі (об'єктив 90х, окуляр 10х або 7х), використовуючи фільтри для препаратів, оброблених кон'югатами з флуоресцеїн-5-ізотіоціанатом. В мазках виявляються рикетсії у вигляді яскраво флуоресціюючих коко-бацилярних корпускул зеленого кольору.
Облік результатів проводять за умовною 4-плюсовою шкалою. Результат оцінюють як позитивний при виявленні в окремих полях зору не менше 5 рикетсій з інтенсивним свіченням збудника не менше, ніж на 3+, при негативному контролі.
В непрямому варіанті МФА на відзначені олівцем поля фіксованих і висушених мазків наносять по краплі специфічні нефлуоресціюючі (нативні) сироватки лабораторних тварин (наприклад, кроля або морської свинки) проти пошукованних рикетсійних антигенів, в чотирьохразовому титрі (титр сироватки вказано на етикетці ампули або визначають безпосередньо в РЗК; наприклад, при титрі 1:320 беруть розведення 1:80). Один мазок залишають для контролю. Мазки у зволоженій камері (чашці Петрі) поміщають на 45 хвилин у термостат (37 град. С). Потім мазки промивають фосфатним буферним розчином (рН 7,2-7,4) протягом 10 хвилин і висушують на повітрі.
Після висушування на мазки наносять антивидовий (відповідно використаній специфічній сироватці) люмінесціюючий гамаглобулін (сироватку) в робочому розведенні (умови розведення позначені на етикетці ампули). Мазки у зволоженій камері зберігають 30 хвилин при температурі 37 град. С. Для гасіння неспецифічної флуоресценції до антивидового гамаглобуліну (сироватки) додають у рівних співвідношеннях бичачий альбумін, мічений родаміном. Після експозиції препарати промивають у двох порціях фосфатного буферного розчину протягом 10 хвилин, споліскують дистильованою водою, просушують на повітрі і мікроскопують в люмінесцентному мікроскопі.
