Страница 2: ДСТУ ГОСТ 30726-2002. Продукти харчові. Методи виявлення та визначення кількості бактерій виду Escherіchіa colі (61291)

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение (24±3) ч.

На среде Эндо E.coli образует колонии от бледно-розового до темно-красного цвета часто с металлическим блеском.

Для дальнейшего подтверждения принадлежности выросших колоний к E.coli отбирают по три колонии каждого типа.

Из отобранных колоний приготавливают мазки, окрашивают их по Граму по ГОСТ 30425. Параллельно в каждой отобранной колонии у бактерий по ГОСТ 29184 определяют отсутствие оксидазы.

Оксидазоотрицательные бактерии пересевают на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара. Посевы инкубируют до появления видимого роста при температуре (36±1) °С.

Культуру высевают в пробирку с бульоном Хотгингера, приготовленным по 6.2.5, или мясо- чептонным бульоном с триптофаном, приготовленным по 6.2.4. Под пробку в пробирку помещают полоску индикаторной бумажки, приготовленной по 6.1.4. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 24 ч. Если за время инкубирования посевов в среде накапливается индол, то желтый цвет индикаторной бумажки меняется на цвет от сиренево-розового до интенсивного малинового.

Образование индола можно определить с помощью реактивов Эрлиха и Ковача, приготовлен­ных по 6.1.2. Для этого к 5 см³ 24-часовой культуры добавляют 1 см³ одного из реактивов. Образо­вание красного слоя на поверхности культуральной жидкости указывает на положительную реакцию.

E.coli образует индол.

Культуру высевают в пробирки со средой Кларка, приготовленной по 6.2.7. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч.

После инкубирования посевов к 1 см³ отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см³ раствора а-нафтола, приготовленного по 6.1.3, и 0,2 см³ раствора гидроокиси калия, приготовлен­ного по 6.1.5. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через 15—60 мин указывает на положительную реакцию.

E.coli не образует ацетоин.

Культуру высевают в пробирки со средой Козера, приготовленной по 6.2.9, или на поверхность среды Симмонса, приготовленной по 6.2.10. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 24—48 ч.’ Изменение оливково-зеленого цвета сред на васильковый, синий указывает на положительную реакцию.

E.coli не утилизирует цитрат.

Культуру высевают в пробирки с глюкозо-фосфатным бульоном или средой Кларка или используют посевы после отбора 1 см³ культуральной жидкости по 7.4.2. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч. К 5 см³ культуральной жидкости прибавляют 5—10 капель реактива Кларка, приготовленного по 6.1.1. Появление через 1 мин красного цвета культуральной жидкости указывает на ферментацию углеводов до pH ниже 5,0.

E.coli интенсивно ферментирует углеводы (реакция с метил-рот положительная).

Культуру высевают в среды Гисса с сорбитом или глюкозой, или лактозой приготовленные по 6.2.11. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч, а на среде Гисса с лактозой при температуре (44±1) °С в течение 24 ч.

E.coli ферментирует глюкозу, лактозу и сорбит.

При ферментации глюкозы образуется газ. Ферментацию глюкозы можно учитывать в засеян­ных косяках трехсахарного агара или среды Клиглера по изменению цвета столбика среды и образованию в нем газа.

Ферментацию лактозы учитывают по изменению цвета скошенной поверхности среды Клиг­лера.

Ферментацию сорбита учитывают по изменению цвета среды.

У культур типичных для E.coli по всем изученным признакам, но не ферментирующим сорбит, изучают возможность ферментации целлобиозы на среде, приготовленной по 6.2.11, при температуре (36±1) °С в течение 24 ч. E.coli не ферментирует целлобиозу, цвет среды не меняется.

Образование сероводорода учитывают в посевах на среду Клиглера или трехсахарный агар после инкубирования посевов при температуре (36±1) °С в течение 24 ч. Почернение в столбике среды указывает на образование сероводорода.

E.coli не образует сероводород.

1А.1 Для биохимической идентификации выявленных бактерий допускается использование тест-систем промышленного производства.

3. Обработка результатов анализа

   1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

   2. К бактериям E.coli относят оксидазоотрицательные не образующие спор грамотрицательные палочки, обладающие способностью ферментации лактозы при температуре (44+1) °С, ферменти­рующие глюкозу и сорбит, дающие положительную реакцию с метил-рот, образующие индол, необразующие ацетоин и не утилизирующие цитрат. Бактерии не ферментирующие сорбит и целлобиозу, но по другим биохимическим признакам давшие типичные для E.coli реакции, относят к сорбитотрицательным штаммам E.coli. Основные дифференцирующие признаки видов рода Es­cherichia приведены в приложении А.

   3. Посевы навески продукта в жидкие среды считают положительными, если при последую­щем пересеве и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной колонии будут обнаружены E.coli.

   4. НВЧ E.coli в 1 г (см³) продукта определяют по количеству положительных колб (пробирок) по ГОСТ 26670.

   5. Если при Подтверждении характерных колоний (при определении количества E.coli посевом «в» или «на» агаризованные среды) в 66 % случаев, то есть не менее чем в 2 из 3 колоний, подтвержден рост E.coli, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри (см. 7.3), принад­лежат к E.coli. В остальных случаях количество E.coli определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Пересчет количества E.coli, определенного посевом в (или «на») агаризованные среды, на 1 г (см³) продукта проводят по ГОСТ 26670.

ПРИЛОЖЕНИЕ А
(рекомендуемое)

Основные дифференцирующие признаки видов рода Escherichia

07.100.30

Ключові слова: грамотрицательные бактерии, питательные среды, инкубирование посевов, индол, ацетоин, утилизация цитрата, колонии, ферментация углеводов.

Підписано до друку 23.09.2002. Формат 60x84 1/8.

Ум. друк. арк. 1,39. Зам ■ Ціна договірна.

Редакційно-видавничий відділ УкрНДІССІ
03680, МПС, м. Київ-150, вул. Горького, 174