Для разбавления вод со значительным содержанием органических веществ применяют дистиллированную воду, полученную перегонкой в стеклянном перегонном аппарате, ее же применяют для приготовления растворов.
Разбавляющая вода должна быть насыщена кислородом и храниться в темноте, защищенной от каких бы то ни было загрязнений. В качестве питательных солей в нее вносят в день применения по 1 мл растворов (в рачете на 1 литр):
фосфатный буферный раствор, рН = 7,2. К2HРO4, х.ч., КH2РO4, х.ч., № a2РO4 x 7 H2O, х.ч. № H4Cl, х.ч.;
8,5 г KH2PO4, 21,75 г K2HPO4, 33,4 г № a2HPO4 x 7 Н2O и 1,7 г № H4Cl растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л (реактивы применяются химически чистые);
раствор сульфата магния MgSО4 х 7Н2О, х.ч.
22,5 г MgSO4 x 7 Н2O растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л в мерной колбе;
раствор хлористого кальция CaCl2, х.ч.
27,5 г CaCl2 безводного растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 литра в мерной колбе;
раствор хлористого железа FeCl3 x 6 H2O, х.ч.
0,25 г FeCl3 x 6 H2O растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л в мерной колбе.
Затем к разбавляющей воде прибавляют 1 м свежей хозяйственно-бытовой воды (сохранявшейся не более 24 час.) или 10 - 20 мл речной воды на каждый литр разбавляющей воды.
Исследуемую воду переливают в колбу и доводят до 20°С (путем нагревания на водяной бане или охлаждения), после чего взбалтывают в течение 1 минуты для насыщения ее воздухом.
Дав выйти пузырькам воздуха, с помощью сифона наполняют 3 склянки с притертыми пробками водой наполовину, ополаскивают и потом наполняют до краев. В одной из них определяют растворенный кислород. Две других склянки с испытуемой водой ставят в термостат горлом вниз на 5 суток, по прошествии которых определяют оставшийся растворенный кислород.
Разность между начальным и конечным определениями, пересчитанная на 1 л, дает величину кислорода, пошедшего на окисление органических веществ в испытуемой воде в течение 5 суток.
Так как в случае загрязненных вод растворенного кислорода может не хватить для покрытая всей потребности воды в кислороде, то указанные воды необходимо перед началом определения разбавить разбавляющей водой. Разбавление должно быть таким, чтобы убыль кислорода за 5 суток была не менее 2 мг/л и чтобы остаток его по истечение этого времени не был ниже 2 мг/л.
Если БПК_5 совершенно неизвестно, необходимо делать несколько разбавлений, например 1:1, 1:4, 1:6 и т.д.
Разбавленную воду аэрируют путем взбалтывания, разливают по склянкам и ведут в ней определение растворенного кислорода.
Для контроля необходимо производить определение БПК_5 самой разбавляющей воды с добавленными реактивами, оно не должно превышать 0,3 мгО2/л. Поправка вносится в расчет.
Ход определения. В кислородную склянку, заполненную доверху, прибавляют или раствора сульфата или хлорида марганца и 2 мл щелочного раствора йодида калия. После выпадения осадка гидроокисей марганца кислородную склянку открывают и пипеткой с широким концом, опущенным под уровень пробы, прибавляют 2 мл разбавленной (1:4) серной кислоты. Кислородные склянки вновь закрывают и, перевертывая, перемешивают их содержимое. Затем содержимое кислородной склянки переливают в колбу для титрования и ополаскивают склянку дистиллированной водой, сливая ее в ту же колбу.
Если для фиксации кислорода применялся раствор едкого калия без иодида, в колбу прибавляют еще 2 мл раствора иодида калия.
Через 5 минут содержимое колбы титруют раствором тиосульфата натрия.
Содержание растворенного кислорода в мг/л расчитывают по формуле:
где
а - количество тиосульфата, пошедшее на титрование в мл;
К - поправка для приведения концентрации раствора тиосульфата к точно используемой концентрации;
н - нормальность раствора тиосульфата;
8 - эквивалент кислорода;
у1 - объем кислородной склянки;
y2 - общий объем реактивов, прибавленных в кислородную склянку.
Расчет БПК_5 без разбавления.
X - БПК_5 в мг/л кислорода;
а - содержание растворенного кислорода в воде до инкубации в мг/л;
в - содержание растворенного кислорода в воде после инкубации в мг/л.
Расчет БПК_5 с разбавлением
X - БПК_5 в мг/л кислорода;
А - содержание растворенного кислорода в воде до инкубации в мг/л;
В - содержание растворенного кислорода в воде после инкубации в мг/л;
а - содержание растворенного кислорода в разбавляющей воде до инкубации в мг/л;
в - содержание растворенного кислорода в разбавляющей воде после инкубации в мг/л;
N - величина разбавления (во столько раз разбавлена проба).
______________________________
** Руководство по химическому анализу поверхностных вод суши", М., Гидрометеоиздат, 1977, с. 339.
Унифицированные методы исследования качества вод, СЭВ, 1977, с. 96.
Методика технологического контроля работы очистных сооружений городской канализации. М., Стройиздат, 1977, с. 60.
3.4. Определение содержания остаточного хлора (иодометрический метод)***
Ход определения
В коническую колбу насыпают 0,5 г иодистого калия, растворяют его в 1 - 2 мл дистиллированной воды, затем добавляют буферный раствор в количестве, приблизительно равном полуторной величине щелочности анализируемой воды, после чего добавляют 250 - 500 мл анализируемой воды.
Выделившийся иод оттитровывают 0,005 н раствором тиосульфата натрия из микробюретки до появления светло-желтой окраски, после чего прибавляют 1 мл 0,5%-ного раствора крахмала и раствор титруют до исчезновения синей окраски.
При определении щелочности воду предварительно дехлорируют с помощью тиосульфата натрия в отдельной пробе.
При концентрации хлора менее 0,3 мг отбирают для титрования большие объемы воды.
Содержание суммарного остаточного хлора (X), мг/л вычисляют
где
y - количество 0,005 н раствора тиосульфата натрия, израсходованное на титрование, мл;
К - поправочный коэффициент нормальности раствора тиосульфата натрия;
0,177 - содержание активного хлора, соответствующее 1 мл 0,005 н раствора тиосульфата натрия;
V - объем пробы воды, взятой для анализа, мл.
______________________________
*** ГОСТ 18190-72 "Вода питьевая. Методы определения содержания остаточного активного хлора".
4. Методы санитарно-микробиологического анализа очищенных и обеззараженных судовых сточных вод
4.1. Отбор, хранение и транспортировка проб воды.
Для бактериологического анализа пробы отбирают в местах выемки воды для химического анализа. В момент отбора проб измеряют температуру воды.
Пробу воды отбирают с соблюдением правил эпидемической безопасности в стерильные емкости в количестве не менее 0,5 литра. Пробы хлорированной воды отбирают в склянку, в которую до стерилизации вносят тиосульфат натрия из расчета 10 - 13 мг на 500 см3 проб сточной воды.
Из одной точки в первую очередь отбирают пробы для микробиологических исследований, а затем для других целей. Посуду открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и горлышко не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду не следует.
После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой, обеспечивающей герметичность (корковой, резиновой или ватной, обернутой фольгой и т.п.) и стерильным колпачком.
При невозможности проведения анализа на месте, отобранные пробы транспортируют в лабораторию в сумках-холодильниках или термоконтейнерах.
Во время перевозки пробы воды следует предохранять от замерзания, действия прямых солнечных лучей, избегать резких толчков, опрокидывания и замачивания пробок. Исследование воды должно быть произведено не позднее 6 часов с момента ее отбора при условиях хранения пробы при температуре +4 - +10°С.
4.2. Аппаратура, лабораторная посуда, материалы, реактивы
По ГОСТ 18963-73 "Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа".
4.3. Метод мембранных фильтров
Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранный фильтр, выращивании их при температуре 37°С +- 0,5°С на среде Эндо в течение 24 часов, дифференцировании выросших колоний и подсчете количества лактозоположительных кишечных палочек в 1 дм3 воды. Данный метод является предпочтительным при анализа судовых сточных вод.
Объем воды выбирают в зависимости от степени ее предполагаемого загрязнения с расчетом, чтобы не менее, чем на 2-х фильтрах выросли изолированные колонии, среди которых не более 30 колоний относятся к лактозоположительным кишечным палочкам. При этом можно ориентироваться на результаты предыдущих исследований, исходят из предполагаемой степени загрязнения сточных вод, времени, в течение которого сточные воды остаются в установке.
При исследовании воды неизвестной степени бактериального загрязнения следует засевать не менее 4-х десятикратных ее объемов (1,0; 0,1; 0,01; 0,001 см3).
Для фильтрования используют мембранные фильтры МФА-МА (фильтрующие мембраны "Владипор" № 5, 6 и 8 и предварительные № 10).
Подготовка мембранных фильтров к анализу осуществляют в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
Фильтрование воды выполняют о помощью специальных приборов с соблюдением правил стерильности, фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через 1 фильтровальный аппарат, меняя каждый раз фильтры. При фильтровании 1 см3 воды в воронку наливают сначала 5 - 10 см3 стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду с последующим созданием вакуума.
После окончания фильтрования мембранный фильтр снимают при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на нижней стороне фильтра. Фильтр переносят на среду Эндо, не переворачивая, и добиваются полного прилегания его к среде без пузырьков воздуха. На одну чашку можно помещать несколько фильтров, но с условием, чтобы они не соприкасались. Для посева используют среду Эндо с добавлением фуксина (на 100 см3 среды прибавляют 0,1 - 0,2 см3 10% спиртового раствора основного фуксина).
Если анализируемая вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток фитопланктона, то ее фильтруют сначала через предварительный мембранный фильтр № 10 для удаления крупной взвеси, который помещают в фильтровальный аппарат, накладывая фильтр для бактериологического анализа. После окончания фильтрования фильтры переносят на среду Эндо раздельно и при выведении результатов анализа учитывают колонии, выросшие на обоих фильтрах.
Чашки с посевами помещают в термостат дном вверх и инкубируют при температуре 37° +- 0,5°С. К учету результатов приступают при отсутствии роста колоний - через 24 часа, при наличии колоний - через 18 часов.
Для учета выбирают фильтры, на которых выросли изолированные полонии и число колоний, характерных для лактозоположительных кишечных палочек, не более 30. Допустимо вести учет по одному фильтру или на фильтрах с более густым ростом, но с обязательной оговоркой в приложении к протоколу анализа.
Выполняют оксидазный тест. Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями переносят на кружок фильтровальной бумаги несколько большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом для определения аксидазной активности. Оксидазный тест можно ставить с помощью СИБ-оксидазы, для чего мембранный фильтр с выросшими на нем колониями переносят пинцетом не переворачивая на бумажный диск СИБ-оксидазу диаметром 3,6 - 4 см (по наиболее принятому размеру фильтра), который предварительно рекомендуется смочить стерильной дистиллированной водой. Через 2 - 5 мин. после достаточного четного проявления реакции (сине-фиолетовая окраска ободка или всей колонии оксидазоположительных бактерий) фильтр переносят обратно на среду и учитывают результат*(4).
Все колонии, которые приобрели сине-фиолетовую окраску или синий ободок, из учета исключают. Среди колоний, не изменивших первоначального цвета (оксидазоотрицательных) подсчитывают количество красных и с металлическим блеском и без него, а также розовых слизистых крупных выпуклых, розовых с темно-красным центром (с отпечатками на обратной стороне фильтра, до выполнения оксидазного теста). Анализ может быть завершен на атом этапе.
В сомнительных случаях, тогда необходимо подтвердить принадлежность колоний к лактозоположительным кишечным палочкам, а также при отсутствии реактива для оксидазной активности подсчитывают отдельно каждый тип колоний, которые по морфологии и окраске можно предположительно отнести к ферментирующим лактозу кишечным палочкам (темно-красные с металлическим блеском и без него, красные, розовые с красным центром, розовые выпуклые слизистые и других оттенков с отпечатками на обратной стороне мембранного фильтра). По 3 - 4 колонии каждого типа микроскопируют после окраски по Граму, пересевают в полужидкую среду с лактозой (уколом до дна) или в пептонную воду с СИБ-лактозой.
Посевы инкубируют в течение 4 - 5 часов при температуре 37 +- 0,5°С. При наличии кислоты и газа исследуемую колонию относят к ЛКП, при отсутствии изменения среды - не учитывают. При наличии только кислоты посев оставляют в термостате и окончательный учет производят через 24 часа.
Результат анализа выражают в виде кали-индекса - количество лактозоположителыных кишечных палочек в дм3 воды. Суммируют количество колоний ЛПК на таких фильтрах, где выросло не более 30 изолированных колоний, и делят на объем профильтрованной воды, выраженный в дм3.
Например: если при посеве 1; 0,1; 0,01 и 0,001 см3 воды на 4 фильтра на одном из них выросло 3 колонии, а на втором 5 колоний, то коли-индекс равен 35:0,00111 дм3 = 3154.
Примечание: при необходимости сохранения жизнеспособности бактерий, выросших на фильтрах, следует учитывать бактерицидность реактива для определения оксидазного теста. Поэтому высев колоний в полужидкую среду с лактозой и другие среды производят немедленно после проявления реакции и не позднее 5 - 7 мин от начала контакта с реактивом.
4.3.2. Титрационный метод
Объем воды для посева в лактозо-пептонную среду накопления выбирают с таким расчетом, чтобы в наименьших объемах получить один или несколько отрицательных результатов. При исследовании сточных вод можно ограничиться посевом одного ряда разбавлений и производить посев, начиная с 1 см3 (1,0; 0,1; 0,01; 0,001).
