---

вносятся в окружающую среду (например, микробные пестициды,

удобрения и стимуляторы роста растений, микробные деструкторы)

изучают выживание микроорганизмов, которые входят в состав

4.2.4. Примеры расчетов величины легочной вентиляции для

мышей:

А. Фиксированное значение величины легочной вентиляции на

протяжении 4- часовой экспозиции для мышей весом 18 г составляет:

V (4 час) = 1,24 куб. см/г/мин х 18 г х 240 хв = 0,0027 куб. м

-------------------------------------------------

1000000

Б. Фиксированное значение величины легочной вентиляции на

протяжении 24- часовой экспозиции составляет для мышей:

V (24 час) = 1,24 куб. см/г/мин х 18 г х 1440 мин = 0,032 куб. м

-------------------------------------------------

1000000

4.2.5. Примеры расчета концентрации микроорганизмов в

4

воздухе при интраназальном введении крысам массой 200 г 10

КУО/животное:

А. Для условий рабочей зоны:

К = 10000 = 3,2 х 105 КУО/куб. м

------

0,0312

Б. для условий атмосферного воздуха:

4

К = 10000 = 5,3 х 10 КУО/куб. м

------

0,1872

4.2.6. Ежедневно наблюдают за общим состоянием животных, за

состоянием кожи и мехового покрова, потребления корма и воды.

Особое внимание уделяется проявлениям симптомов поноса,

конвульсий, сонливости, слюнотечения. Масса животных определяется

перед введением материала, через 1 мин, при гибели животных и при

забое. При гибели животных и при забое проводится вскрытие

животных, бактериологическое и гистологическое исследование

внутренних органов. Через 1 месяц от начала введения культуры,

перед забоем и до конца восстановительного периода проводятся

также гематологические исследования, определение иммунотоксичности

и дисбиотического действия.

5. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ МИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА

НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ ОРГАНИЗМА

5.1. Определение порога иммунотоксического действия

Иммунотоксическое действие микробного препарата может

проявляться сенсибилизацией, иммунизацией (признак антигенности

микроорганизма) и неспецифической имуномодуляцией.

5.1.1. Проведение кожаных проб

Исследуемый материал (прогретой при 80 град. С живая культура

производственного штамма) суспензируется в физрастворе. 0,05-0,1

куб. см вводится в обработанную спиртом кожу внешней поверхности

уха морской свинки с помощью туберкулинового шприца. При этом иглу

нужно вынимать зигзагообразно, чтобы не было потери суспензии.

Учет реакции - через 20 мин. для выявления аллергии немедленного

типа и через 24-48 час. для выявления аллергии медленного типа.

Положительная реакция выражается в появлении на месте введения

вещества покраснения, припухлости. Используется 6 опытных и 6

контрольных животных.

При необходимости, в зависимости от интенсивности эффектов,

может быть использован более широкий спектр методов и показателей.

5.1.2. Определение гиперчувствительности медленного типа (ГПТ)

Животных, которые подлежали длительному ежедневному действию

препаратом,

5

иммунизируют одноразово внутрикожно 2 х 10 эритроцитов барана

8

в 0,05 куб. см физиологического раствора. На 5-в сутки вводят 10

эритроцитов в 0,05 куб. см физиологического раствора в подушечку

задней лапки (решающая инъекция). В контрольную лапку вводят

физраствор в том же объеме. Местную воспалительную реакцию

(интенсивность ГУТ) оценивают через 24 час. по разнице толщины

опытной и контрольной лап (замеряют инженерным микрометром

МК-0-25). Вычисляют среднеггрупповые показатели отека у животных

контрольной (6 животных) и опытной групп (6 животных). Результаты

выражают в условных единицах (,одна равна 0,01 мм.

5.1.3. Определение антител к эритроцитам барана

Крысам опытной (6 животных) и контрольной (6 животных) групп

вводят внутриполостно 0,5 куб. см 50% суспензии эритроцитов

барана. На 7-е, 14-е, 21-е, 28 сутки после введения эритроцитов из

хвостовой вены животных в пробирку вносят по 0,5-1 куб. см крови.

Пробирки размещают в термостате при +37 град. +-1 град. С на 20

мин, потом переносят в холодильник при +6 град. +-2 град. С на 18

час., после чего пастеровской пипеткой отбирают сыворотки,

подогревают их при +56 град. С на протяжении 20 мин на водяной

бане, а далее разводят дважды физраствором - 1:4, 1:8 и в объеме

0,25-0,5 куб. см на планшетах.

К разведенным сывороткам добавляют 0,1 куб. см 2% суспензии

эритроцитов барана, встряхивают и выдерживают при комнатной

температуре.

Предварительный учет результатов реакции проводят через 2

час., а окончательный - через 18-24 час.

При положительной реакции кружевоподобный осадок эритроцитов

в виде тонкой пленки с неправильными волнистыми краями

(перевернутый зонтик) распределяется равномерным слоем по дну. При

отрицательной реакции эритроциты оседают в форме компактного

небольшого диска или обручального кольца с ровными краями.

Результаты реакции выражают в условных единицах (титрах) - по

наибольшему разведению сыворотки, которая дает положительную

реакцию, т.е. полную аглютинацию 0,1 куб. см 2%-ной суспензии

эритроцитов барана. Уменьшение титра антител свидетельствует об

угнетении действия препарата на гуморальное звено иммунного

ответа. Увеличение титра свидетельствует о стимулирующем действии.

5.1.4. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов

Из исследуемой культуры производственного штамма

микроорганизма готовят суспензию на физиологическом растворе в

концентрации

9

10 клеток/мл; 0,1 куб. см этой суспензии добавляют в 0,1 куб. см

гепаринизованой крови опытных и контрольных животных, смешивают и

инкубируют при +37 град. +-1 град. С на протяжении 30 мин., после

чего готовят мазки для подсчета форменных клеток крови.

Подсчитывают 200 нейтрофилов, вычисляют процент фагоцитирующих

нейтрофилов, т.е. количество лейкоцитов с 100, которые обнаружили

фагоцитарную активность. В опыт берутся не меньше чем по 6

животных как в опытной, так и в контрольной группе.

5.2. Изучение дисбиотического действия

5.2.1. При изучении действия производственного штамма

микроорганизмов или микробного препарата на аутофлору (резидентную

микрофлору) организма как тест-система используется микробиоценоз

толстого кишечника лабораторных животных. На каждую дозу

исследуемого объекта используется не меньше 6 животных.

Контрольная группа, которая находится в тех же условиях

существования, но не получает продуцента или биопрепарата, также

должен иметь не меньше 6 животных. Следует заметить, что животные,

которых применяют для изучения аутофлоры, не подлежат другим

исследованиям (т.е., у них не забирают кровь, не травмируют

другими исследованиями). Бактериологическое исследование

содержимого толстого кишечника животных проводится в динамике: до

опыта (фон), через 1 и 2 месяца от начала опыта и в конце

восстановительного периода.

5.2.2. Для посева используют десятикратные разведения фекалий

в физиологическом растворе. Определяют количество микроорганизмов:

кишечной палочки (посев на среду Эндо), гемолитических бактерий

(посев на 5%-ной кровяной агар), энтерококков (на азидовом агаре),

стафилококков (посев на солевой агар), грибов (на среде Сабуро),

общее количество анаэробов (на МПА в анаэростате).

Все посевы на аэробы инкубируют 24-48 час. при +37 град +-1

град. С, посевы на анаэробы - 24-48 час. в анаеростате при +37

град. +-1 град. С. Определяют количество микроорганизмов в 1 г

фекалий. Критерием дисбактериоза служат изменения, по сравнению с

контрольной группой, количественного состава микрофлоры толстого

кишечника опытных животных.

5.2.3. Если показатели количественного состава микрофлоры

более, чем по двум группам микроорганизмов отличаются от контроля,

но после периода восстановления эти изменения исчезают, то

дисбиотическое действие оценивается как умерено выраженное. При

гигиеническом нормировании дозу (или концентрацию)

производственного штамма микроорганизмов или биопрепарата, которая

вызывает дисбактериоз, следует считать порогом дисбиотического

действия.

Если количественный состав микрофлоры кишечникы опытных

животных отличается от показателей контрольной группы хотя бы по

одной из выученных групп микроорганизмов, но изменения не исчезают

после восстановительного периода, то это рассматривается как

сильное дисбиотическое действие. Дозу или концентрацию, которая

вызвала сильное дисбиотическоне действие, следует считать

действующей по этому эффекту.

6. ГИГИЕНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

6.1. Исследование влияния микробного препарата на процессы

микробной самоочисткиводы и грунта

6.1.1. Исследование влияния микробного препарата на

санитарный режим воды и грунта проводится в случаях, когда имеет

место загрязнение окружающей среды. Например, когда при

производстве микробного препарата наблюдаются выбросы

производственных штаммов микроорганизмов в окружающую среду и

загрязнение воды водоемов или грунта, или, когда микробные

препараты вносятся в окружающую среду при их применении (микробные

пестициды, микробные биоудобрения и стимуляторы роста растений,

деструкторы химических загрязнителей). Опыты проводятся со штаммом

микроорганизма-продуцента - основным действующим ингредиентом

микробного препарата.

6.1.2. В эксперименте с водой используют аквариумы емкостью 5

куб. дм и больше. Микроорганизмы вносят одноразово в воду,

отобранную из открытого водоема в количестве, которое отвечает

максимальной норме его сельскохозяйственного или экологического

применение, а также на 1-2 порядка выше и ниже. Исследуются сроки

выживаемости продуцента в воде и влияние на процессы микробной

самоочистки от санитарно-показательной и патогенной микрофлоры.

Для этого в исследуемую воду вносят, кроме производственного

штамма, также Э. coli, S. typhimurium в количестве

5

5 х 10 КУО/куб. дм.

6.1.3. Действие продуцента на процесс нитрификации

органических веществ определяют по содержанию нитритов и нитратов.

Контролем служит вода, в которую не вносился продуцент.

Исследования проводят при комнатной температуре в динамике: до

внесения продуцента в воду (фон), сразу после внесения и на

протяжении 1-3 месяцев (до исчезновения продуцента).

6.1.4. При исследовании самоочищающей способности грунта

используют чернозем или другой грунт с хорошей поглощающей

способностью, высоким содержанием гумуса и нейтральной реакцией

(рН). Устанавливают влажность на уровне 60% от полной

влагоемкости.

Порции грунта (не меньше 1 кг) в стеклянной посудине

перемешивают с продуцентом и вносят санитарно-показательные

микроорганизмы. Наблюдения проводят в динамике, как и исследование

воды.

6.2. Гигиенические исследования условий производства

микробного препарата

6.2.1. При наличии опытного или промышленного производства

необходимо проведение гигиенических исследований с целью

определения загрязнения воздуха рабочей зоны

микроорганизмами-продуцентами. Для этого используются методики,

разработанные для каждого конкретного вида производственного

штамма микроорганизмов.

Кроме того, целесообразно параллельно проводить определение

общего количества микроорганизмов для оценки микробного фона в

помещении, а также возможного загрязнения воздуха микроорганизмами

не производственного назначения. При этом используются

общепринятые питательные среды.

6.2.2. Для забора проб воздуха на микробное загрязнение

используются специальные приборы для микробиологического

исследования воздуха (прибор Кротова, Андерсена, многокаскадные

импакторы и другие приборы). При этом пробы воздуха засеваются

непосредственно на специфическую для исследуемого штамма

питательную среду - жидкую или твердую в зависимости от прибора.

6.2.3. Наряду с обследованием воздуха в производственных

помещениях необходимо проводить медицинские осмотры работающих по

общепринятой схеме для биотехнологических предприятий и анализ

заболеваемости.

Полученные результаты гигиенических исследований используют

вместе с результатами экспериментальных исследований при

обосновании ГДК биопрепаратов.

6.2.4. Натурные наблюдения целесообразно проводить после

выполнения экспериментальных токсиколого-гигиенических

исследований, когда уже должны быть известны лимитирующие признаки

вредности биопрепарата.

Цель гигиенических исследований - определить количество

микробного препарата (производственного штамма), которое может

поступать в организм человека вследствие загрязнения

производственной или окружающей среды, оценить реальную угрозу

здоровью человека и обосновать требования к условиям безопасности

процессов производства биопрепарата или его применения.

7. ОБОСНОВАНИЕ ВЕЛИЧИНЫ ПДК

7.1. При установлении ПДК микробных препаратов в различных

объектах расчеты следует проводить по основному действующему

фактору - производственному штамму микроорганизма-продуцента и

давать ее величину в микробных клетках (КУО) на единицу измерения

объекта среды, для которого предлагается норматив. Если в товарную