З багаточисельної групи фагів як санітарно-показові віруси визначені постійно наявні у кишечнику людини соматичні коліфаги, які у великій кількості потрапляють у стічні води, у водойми зі стічними водами та поверхневим стоком і, як слідство, у питну воду (водопровідну, колодязну та інші джерела).
Коліфаги - це бактеріальні віруси, котрі складаються з капсиду, який вміщує одно- або двуниткову ДНК в якості геному.
Виявлення у воді кишкових бактеріофагів може свідчити про наявність патогенних вірусів, особливо у питній воді. Наявність їх у воді з резервуару чистої води станції водопідготовки вказує на недосконалість технології водопідготовки, а у воді з мережі водопостачання, крім вказаного, - про наявність умов вторинного забруднення, зокрема збудниками вірусних інфекцій.
Коліфаги слугують найбільш адекватною моделлю оцінки ефективності того чи іншого прийому очистки та знезараження води від вірусів. Методи їх визначення доступні лабораторіям любого рівня, не потребують спеціального обладнання та дають можливість отримати результати вже через 6-24 годин.
Бактеріофаги здатні інфікувати певні штами хазяїна E.coli та утворювати видимі бляшки (зони лізису, прозорі зони) різного розміру та морфології на зливному газоні бактеріального росту хазяїна за відповідних умов культивування. Визначення коліфагів можна проводити двома методами:
- титраційним методом (метод накопичення) або найбільш вірогідного числа (НВЧ);
- прямим методом без попередньої концентрації коліфагів та після їх концентрації.
Титраційний метод дозволяє виявляти незначну кількість коліфагів в об'єкті, але загальний об'єм води, як правило, не перевищує . Цей метод застосовується при дослідженні питної води після очистки та знезараження, води з розподільчої системи або інших малозабруднених об'єктів. Отримання результату можливе через 24-48 годин.
Прямий метод застосовується для визначення коліфагів у стічній воді та інших водних об'єктах зі значним антропогенним забрудненням. Застосування прямого методу визначення коліфагів у питній воді має технічну обмеженість внаслідок неможливості дослідження великих об'ємів. В той же час він застосовується для визначення коліфагів у питній воді та інших видах чистих вод після попередньої концентрації фагів з великих об'ємів у малі. Використовують методи концентрації хлоридом алюмінія та ГГМКК. Результат отримують через 6-24 годин.
8.1. Відбір проб для дослідження
Відбір проб різних видів вод для дослідження на наявність коліфагів відрізняється від вказаного в Розділі 4 цих методичних рекомендацій об'ємом проб. Стічну воду відбирають об'ємом 100 мл. Воду з інших об'єктів відбирають об'ємом 1000 мл, якщо не передбачена концентрація. При необхідності концентрації коліфагів пробу відбирають об'ємом .
Необхідність концентрації коліфагів доречно проводити у пробах води за епідпоказниками, коли дослідження води на патогенні віруси негативні, а коліфаги в 1000 мл не визначаються, у той час, як реєструється захворюваність населення на вірусні інфекції з водним шляхом передачі.
Концентрація коліфагів також доречна при дослідженні різних видів питної води з метою надати у короткий строк більш достовірну оцінку можливості проходження вірусів через ті чи інші етапи очисних споруд та можливої наявності вірусів в інших видах вод (колодязній, зі скважини, каптажів, інших індивідуальних джерел питної води).
Незадовільна якість води за санітарно-хімічними та бактеріологічними показниками також може спонукати до визначення коліфагів з їх попередньою концентрацією, що суттєво доповнить характеристику води та роботу очисних споруд стосовно антивірусного бар'єру.
8.2. Дослідження проб стічної води
Кількість коліфагів у стічній воді, як правило, знаходиться на рівні сотень та сотень тисяч в одному мл в залежності від характеру стічних вод та ступеня їх очистки. Допустимий рівень коліфагів в очищеній стічній воді, яку дозволено скидати у водоймище, повинен дорівнювати 1000 бляшкотвірних одиниць в літрі (БТО/л) (СанПиН 4630-88 "Охрана поверхностных вод от загрязнения", Москва, 1988). Стічну воду досліджують двошаровим методом посіву за Граціа. Метод складається з наступних складових:
- приготування тест-культури хазяїна E.coli В або E.coli С;
- приготування чашок Петрі з 2% м'ясо-пептонним агаром (МПА) для нижнього шару;
- приготування суміші відповідних об'ємів досліджуваної проби, культури хазяїна E.coli та 1,0% МПА для верхнього шару агара;
- контроль можливої контамінації фагом середовищ і матеріалів, які використовуються (негативний контроль);
- контроль чутливості тест-культури хазяїна до соматичних коліфагів (позитивний контроль).
Приготування тест-культури хазяїна, постановку негативного та позитивного контролів виконують відповідно до пунктів 11.1.1.; 11.1.4.; 11.1.5 Методичних вказівок MB 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.
8.2.1. Проведення аналізу
Розтоплюють 2,0% МПА і розливають у чашки Петрі по 15-20 мл в
кожну. Флакон зі 100 кв.см 1,0% МПА розтоплюють і доводять до
48 град. С на водяній бані. Використовують десятикратні
розбавлення проби стічної води від 102 до 1012. Всі дози посівів
досліджують у двох повторностях. Вихідну воду досліджують по 1 мл
2 4
з розбавлень (наприклад, 10 та 10 ). Воду після повного циклу
очистки та знезараження досліджують в об'ємі 1 мл вихідної води та
2
з розбавлення 10 . Приготовлені розбавлення по 1 мл розливають у
два ряди пробірок, додають 0,5 мл "нічної" бульйонної культури
хазяїна, 5 мл розтопленого 1,0% МПА та виливають на приготовлений
заздалегідь шар 2,0% МПА у чашках Петрі. Виливають приготовлену
суміш (верхній шар) на нижній шар агару і швидко розподіляють по
поверхні агару, дають можливість застигнути та інкубують у
термостаті при 36 +- 1 град. С протягом 6 годин, після чого
виймають і підраховують кількість бляшок лізису культури хазяїна,
тобто БТО на чашці. Після підрахунку БТО чашки з посівами
залишають до слідуючого дня при кімнатній температурі і роблять
остаточний підрахунок БТО та їх розрахунок на одиницю об'єму
(на мл чи на л в залежності від точки відбору проб). В разі
неможливості інкубації при двух температурах надають перевагу
інкубації при 36 +- 1 град. С. Результат вважається прийнятним при
одержанні відповідних позитивного та негативного контролів.
8.3. Дослідження проб води поверхневих водоймищ
Воду поверхневих водоймищ досліджують об'ємом 10-100 мл в залежності від ступеня їх забруднення. Нижня границя досліджуваного об'єму (10 мл) обумовлена нормативом допустимого рівня коліфагів води поверхневих водоймищ, який дорівнює 100 БТО в одному літрі води. При цьому використовують прямий метод посіву, описаний в п. 9.21 цих методичних рекомендацій з деякими змінами, викладеними нижче. Від загального об'єму проби води відбирають 10 мл і розподіляють цей об'єм по 2,0 мл у 5 пробірок, куди додають 0,5 мл бульйонної культури хазяїна E.coli В, та 5 мл 2,0% МПА. Виливають отриману суміш на нижній шар 2,0% МПА, розлитого в чашки Петрі. Інкубацію проводять як описано в п. 9.2.1. Підраховують загальну кількість БТО на чашках сумарно та розраховують їх кількість в води.
8.4. Дослідження проб питної води
Питна вода з різних джерел водопостачання досліджується об'ємом . У відповідності з діючою нормативною документацією коліфаги у питній воді повинні бути відсутніми в об'ємі (ДСанПіН "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", Київ, 1999). Для дослідження використовується титраційний метод (метод накопичення, або НВЧ) у відповідності з розділом 11.1 Методичних вказівок MB 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.
В разі необхідності концентрації коліфагів досліджують пробу об'ємом . Застосовують метод осадження хлоридом алюмінія або сорбції ГГМКК.
Осадження хлоридом алюмінія. У пробу води, підігріту до
18-20 град. С, додають 10% розчин хлориду алюмінія з розрахунку
2 мл на проби. Доводять рН до 5,8-6,0, обережно перемішують
пробу до утворення пластівців. Залишають пробу на 16-18 годин при
4 град. С до утворення осаду (при неможливості залишають пробу при
кімнатній температурі). Надосадову рідину зливають, а пухкий осад
переносять у чотири 250 мл флакони та центрифугують при
2000 об./хв., протягом 15 хв. Надосадову рідину зливають. У кожний
флакон додають елюент - по 5,0 мл м'ясо-пептонного бульйону (МПБ)
подвійної концентрації з 10% Na HPO (рН 9,2). Флакони з елюентом
2 4
інтенсивно струшують 10 хв. Після цього осад з елюентом переносять
в один флакон і знов центрифугують при вказаному режимі,
надосадову рідину збирають в окремий флакон і досліджують прямим
методом посіву як вказано вище у пункті 5.3. Отриманий об'єм
елюенту розподіляють по 2,0 мл у відповідну кількість пробірок, до
них додається все необхідне у відповідності до пункту 8.3.
|
Заступник директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду |
Л.М.Мухарська |
СПИСОК
використаних джерел
1. Основи законодавства України про охорону здоров'я.
2. "Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні", затв. Постановою Кабінету Міністрів України 22.06.99 N 1109, в редакції Постанови Кабінету Міністрів України від 19.08.02. N 1217.
3. Закон України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення".
4. Закон України "Про захист населення від інфекційних хвороб".
5. ДСП № 9.9.5.064.2000 "Порядок видачі дозволів на роботу із мікроорганізмами 1-4 груп патогенності та рекомбінантними молекулами ДНК".
6. Постанова від 27.05.1998 р. N 11 "Про порядок розробки, викладення, оформлення, затвердження державних санітарних правил і норм, гігієнічних нормативів та методичних документів".
7. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. ВОЗ-2003.
8. "Правила функціонального устрою та експлуатації приміщень лабораторії молекулярно-генетичних досліджень".
9. "Методичні рекомендації по проведенню робіт в діагностичних лабораторіях, які використовують метод полімеразної ланцюгової реакції", Київ, 1995.
10. Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я № 219-2005. Концентрація ротавірусів із стічних вод за допомогою поліметилсилоксанового адсорбенту "Ентеросгель". Автори: Дзюблик І.В., Обертинська О.В., Миколенко Н.І., Київ, 2005.
11. Методичні вказівки МВ 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.
12. СанПин 4630-88 "Охрана поверхностных вод от загрязнения", Москва, 1988.
13. ДСанПін "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", Київ, 1999.
14. Методичні рекомендації "Організація роботи лабораторії при дослідженні біоматеріалу методом полімеразної ланцюгової реакції", Київ, 2007.
15. Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я № 247-2005 "Застосування швидких імунохроматографічних тестів в діагностиці ротавірусної інфекції у дітей в спеціалізованих дитячих лікувальних закладах". Дзюблик І.В., Ковалюк О.В., Обертинська О.В., Костенко О.О., Київ, 2005.
Додаток 1
до Методичних вказівок
АПАРАТУРА,
основні матеріали, реактиви, поживні середовища
Для проведення санітарно-вірусологічного дослідження використовують:
- Автоклав великий (або настільний для маленьких лабораторій).
- Бокс біологічної безпеки з запасними фільтрами безпеки II класу (ламінарна шафа).
- Ваги (аналітичні , електронні, торсійні, лабораторні).
- Водяна баня.
- Дистилятор води електричний.
- Дозатори автоматичні (одно- та восьмиканальні).
- Ізотермічні сумки.
- Камера підрахунку клітин.
- Колби скляні з градуйованою горловиною.
- Колби скляні лабораторні.
- Мікроскоп інвертований.
- Морозильна камера (-20 град. С) типу прилавка; морозильна камера (-70 град. С).
- Одноразовий посуд для культивування культур клітин - стерильні культуральні флакони, пробірки, планшети, піпетки тощо.
- Посуд для відбору проб води з об'єктів довкілля.
- Посуд медичний скляний.
- Пробірки скляні.
- Пробки конусоподібні.
- РН-метр з запасними електродами будь-якої марки або фірми-виробника.
- CO -інкубатор.
2
- Стерильні скельця для культури клітин.
- Сухожаровий стерилізатор.
- Термометри стандартні (0-100 град. С).
- Апарат для фільтрації будь-якої марки або фіми-виробника.
- Ультрафільтраційна система "Мінітан".
- Термостати електричні, сухожарові з автоматичним терморегулятором до 50 град. С.
- Утримувач фільтрів розміром 30, 70, .
- Холодильник побутовий елетричний з температурою камери 4-6 град. С.
- Центрифуга лабораторна рефрижераторна.
- Центрифуга низькошвидкісна з охолодженням.
- Циліндри вимірювальні ємністю 100, 250, 500 куб.см.
- Чашки Петрі (діаметром 90-).
- Алюміній сірчанокислий.
- Аеросил-300, Калушського дослідного виробництва IX поверхонь АН України (Івано-Франківська обл.), ГОСТ 14922-77.
- Вата медична гігроскопічна.
- Калій фосфорнокислий двозаміщений.
- Кислота оцтова.
- Трис буфер рН 8,4
- Лейкопластир.
- Марля медична.
- Натрій фосфорнокислий двозаміщений безводний.
- Поліетиленгліколь з М.В. 6000, 4000.
- Гідрогель метилкремнієвої кислоти ГГМКК виробництва КРЕОМА ФАРМ, Київ (вул. Радищева, 3; м. Київ, Україна 03680, тел. (044) 455-35-40/41 тел./факс (044) 497-95-45).
