5.3.1. Реакція аглютинації. В реакції аглютинації (РА) застосовують комерційні кашлюкові та паракашлюкові діагностикуми. РА можна ставити в аглютінаційних пробірках згідно інструкції до діагностикума або в планшетах.
При застосуванні мікрометоду користуються 1,8% розчином NaCl, а для полегшення обліку реакції комерційний діагностикум підфарбовують розчином метиленової синьки. Для цього у 5 мл діагностикума додають 2-3 краплини (0,1 мл) водно-лужного розчину метиленової синьки, що готується таким чином: готують 10% спиртовий розчин метиленової синьки на 96% етиловому спирті; готують водно-лужний розчин метиленової синьки (на 30 мл 10% спиртового розчину синьки додають 1 мл 1% їдкий натр або йодний калій, яким і користуються).
При постановці РА з досліджуваної сироватки готують 9-10 двократних розведень від 1:10 до 1:5120. Ставлять два контролі:
1. Контроль діагностикума - 0,025 мл забарвленого діагностикума та 0,025 мл 1,8% розчину NaCl;
2. Контроль сироватки - 0,025 мл фізіологічного розчину та 0,025 мл сироватки.
Після цього планшети енергійно струшують протягом 2-3 хвилин, ставлять в термостат на 2 години при температурі (36 +- 1) град. С (щоб запобігти висихання, планшети закривають полістироловими кришками або склом), після чого їх залишають при кімнатної температурі (20 +- 2) град. С ще на 18-20 годин.
Облік РА проводять згідно інструкції по застосуванню кашлюкового діагностикума та по наявності "парасольок" в лунках планшету.
За кінцевий титр в РА слід вважати розведення, при якому відмічається чітка аглютинація на 2 хрести (++). Однак реакція вважається позитивною лише при наявності у попередніх пробірках або лунках чіткої аглютинації на чотири або три хрести (++++ або +++).
Крім РА для визначення аглютинаційних антитіл використовується також РПГА. Схема постановки та обліку цієї реакції наведено в інструкції по застосуванню.
У вакцинованих серологічні дослідження проводять через 1,5 місяця після третього щеплення або ревакцинації. Титр антитіл 1:160 та більше умовно прийнятий за захисний титр. Однак повної кореляції між рівнем аглютинінів і захищеністю від інфекції немає, що пов'язано з нестандартністю та низькою чутливістю бактерійних діагностикумів. Найбільш доцільно РА (а також ІФА) використовувати для вивчення імуноструктури населення. Слід відмітити, що більш чутливою, ніж РА, є реакція непрямої гемаглютинації (РНГА), але внаслідок її нестандартності вона майже не використовується в нашій країні та за кордоном. Найбільш чутливим із серологічних тестів є ІФА, який є методом вибору при визначенні наявності антитіл до різних антигенів Bordetella pertussis.
5.3.2. Імуноферментний аналіз. Як антиген в ІФА використовується ліпополісахарид (ЛПС), протективні антигенні комплекси, такі як кашлюковий токсин (КТ), філаментозний гемаглютинин (ФГА), аглютиноген (АГ), пертактін та безклітинний комплекс протективних антигенів B. pertussis, який містіть кашлюковий токсин та аглютиноген (БКПА).
Використання цих антигенів в ІФА дає змогу визначити наявність імуноглобулінів G, M, та A при хворобі або внаслідок імунізації. Точність тесту залежить від ступеню очищення антигенів, а також від набору антигенів, який використовується у реакції. Хід дослідження та інтерпретацію результатів слід проводити згідно інструкції по застосуванню тієї чи іншої тест-системи.
Слід відмітити, що існують також інші серологічні реакції: імуноблотінг та реакція нейтралізації. Метод імуноблотінгу засновано на взаємодії антигенів, розділених за допомогою електрофорезу, з антитілами, до яких потім приєднують мічені радіоактивним йодом антитіла до людських імуноглобулінів, а потім здійснюють ауторадіографію.
Визначення рівня токсин-нейтралізуючих антитіл в реакції нейтралізації in vitro проводиться на культурі оваріальних клітин китайських ховрашків. Однак цей метод занадто трудомісткий та дорогий, тому не знайшов широкого використання в практиці і застосовується тільки в наукових лабораторіях.
Примітка. на даний час в країні оцінка протикашлюкового імунітету не проводиться за відсутності відповідних комерційних препаратів.
5.4. Оцінка імунітету проти кору
При оцінці імунної відповіді на вакцинацію проти кору дуже важливим є правильний вибір серологічної тест-системи. Це пов'язано з тим, що рівень післявакцинальних антитіл може бути низьким, тому для виявлення необхідні найбільш чутливі тести.
Для вивчення рівня імунітету проти кору в сучасний період пропонуються різні методи: РПГА, реакція гальмування гемаглютинації (РГГА), ІФА, реакція нейтралізації (РН) для виявлення сумарних вірус специфічних імуноглобулінів, реакція нейтралізації бляшок (РНБ) та ін.
Вивчення появи та динаміки накопичення імуноглобулінів різних класів IgG и IgM має велике значення. При первинній корової інфекції спочатку з'являються IgM. Однак IgM зберігаються недовго, не більше 4 тижнів. Максимальний рівень їх припадає на 7-10 день після появи висипу, а потім різко знижується.
Для діагностики кору ВООЗ рекомендує метод ІФА для виявлення IgM антитіл. Максимально чутливими IgM ІФА тести є в проміжку часу між четвертим та 28 днями від моменту появи висипки. Тому 1 зразок крови, відібраний в цей період є адекватним для серологічної діагностики кору з метою епіднагляду.
IgG-антитіла з'являються в крові майже зразу після появи висипу, і зберігаються на максимальному рівні протягом майже 4 тижнів, після чого титри антитіл поступово знижуються, але потім зберігаються усе життя.
У щеплених людей атенуйованими вакцинами проти кору максимальні значення титрів антитіл нижчі. По деяким даним, у людей з невеликими значеннями післявакцинального імунітету швидше відбувається зниження рівня антитіл. При повторних контактах імунізованих людей з циркулюючим диким вірусом кору антитіла зберігаються довше (до 16 років).
5.4.1. Реакція пасивної гемаглютинації. Суть реакції полягає в тому, що еритроцити, сенсибілізовані антигеном, в присутності гомологічного антитіла склеюються, тобто спостерігається феномен пасивної гемаглютинації. Переваги цієї реакції в тому, що вона достатньо специфічна, проста в постановці, дешевше ніж інші тест-системи, тому вона більш широко використовується при проведенні імунологічного моніторингу.
Поряд з іншими серологічними реакціями РПГА може бути використана для диференційної та ретроспективної діагностики кору. Серологічна діагностика можлива лише при наявності чотирикратного та більше зростання титру антитіл при титруванні парних сироваток або при наявності сероконверсії, тобто переходу негативної імунологічної реакції в позитивну. Першу сироватку беруть не пізніше 3-го дня з моменту появу висипань, а другу - через 3 тижня після цього. Сироватки з титром 1:10 оцінюють як позитивні.
5.4.2. Імуноферментний аналіз. Серед різних модифікацій ІФА для визначення антитіл класу IgG та IgM до вірусу кору застосовується метод подвійного зв'язування. Цей метод базується на тому, що перша реакція зв'язування здійснюється між антигеном вірусу кору, який адсорбований на поверхні лунок планшету та антитілами (IgG або IgM) досліджуваних зразків сироваток, які вносять до планшету. Після інкубації, тобто завершення цієї реакції, планшет відмивається з метою звільнення незв'язаних компонентів в суміші. На стінках лунок залишається лише комплекс антиген-антитіло. Для індикації цих комплексів проводять другу імунологічну реакцію, в якій як антиген виступає комплекс антиген-антитіло, а як антитіло - кон'югат (антитіла проти імуноглобулінів людини, мічених ферментом - пероксидазою хрону). Після завершення другої імунологічної реакції лунки відмивають від лишку кон'югату, а кон'югат виявляють за допомогою субстрату (розчин хромогену - ортофенілендіамін (ОФД) або тетраметилбензидин (ТМБ). Ці безкольорові розчини в присутності перекису водню (утворює кольорову речовину) змінюють колір від блідо-жовтого до оранжево-коричневого. Інтенсивність забарвлення вимірюють на спектрофотометрі при довжині хвилі 450-650 нм, 490-492 нм, (в залежності від тест-системи, яка використовується) по заміру оптичної щільності (ОЩ). Чим вище ОЩ розчину у лунці, тим більша кількість специфічних антитіл знаходиться у відповідному розведенні проби, тобто вище титр сироватки, що досліджується. При відсутності антитіл лунки залишаються незабарвленими. Далі з урахуванням значень ОЩ контрольних проб проводять математичну обробку отриманих результатів дослідження.
Результат аналізу вважається позитивним, якщо значення ОЩ у відповідній лунці дорівнює або перевищує критичне значення (ОЩкрит.), яке підраховують за формулою:
_
ОЩ = ОЩ К + 0,2,
крит. ср.
де ОЩ - оптична щільність критична;
крит.
_
ОЩ К - оптична щільність негативного контрольного зразка.
ср.
Для диференційної діагностики кору необхідно провести аналіз парних сироваток. Якщо відсоток збільшення концентрації IgG у парних сироватках менш 30% - захворювання на кір відсутнє, перевищення цього показника більш ніж 30% свідчить про статистичне достовірне збільшення концентрації IgG, що підтверджує наявність гострої інфекції.
Специфічність та чутливість ІФА досить висока і становить 95-90% відповідно.
5.4.2.1. Варіанти проведення ІФА. ВООЗ рекомендує при виявленні специфічних антитіл до вірусу кору такі варіанти проведення методу ІФА:
5.4.2.1.1. "Подвійний сендвіч" або метод "захвату" IgM антитіл до вірусу кору.
Принцип методу: При проведенні ІФА в цій модифікації IgM антитіла, що знаходяться в сироватці крові хворого, зв'язуються з антитілами проти IgM людини, адсорбованими на твердій фазі. Цей етап реакції не є вірусоспецифічним.
Після цього планшет промивають щоб вилучити інші імуноглобуліни та білки сироватки.
Після промивання антиген, якій зв'язаний з IgM антитілами, виявляють за допомогою моноклональних антитіл до вірусу кору, які входять до складу детекторного реагенту з хромогеном, що виявляє наявність або відсутність специфічних IgM антитіл до вірусу кору в досліджуваному зразку.
Переваги методу: полегшується процедура відбору та дослідження проб, оскільки в більшості випадків достатньо мати тільки одну пробу сироватки.
Висока чутливість, оскільки специфічні корові IgG-антитіла видаляються промиванням вже на першому етапі проведення реакції, а тому на етапі зв'язування антигену не можуть конкурувати з IgM антитілами.
Недоліки: при дослідженні сироваток відібраних в перші 3 дні після появи висипу в 20-30% випадків можуть бути одержані негативні результати.
5.4.2.1.2. Непрямий метод ІФА для виявлення IgM антитіл
Принцип методу: для виявлення IgM антитіл використовують специфічний адсорбент ревматоідного фактору для видалення із сироваток антитіл класу IgG на підготовчому етапі реакції.
Першим етапом даної модифікації ІФА є сорбція специфічного коровго антигену на твердій фазі.
Далі в планшети вносять досліджувані сироватки і специфічні антитіла до вірусу кору (IgM-антитіла так і IgG-антитіла, які залишилися) зв'язуються з антигеном.
Специфічні антитіла класу IgM виявляють або безпосередньо за допомогою мічених ферментом моноклональних антитіл проти IgM людини (прямий метод), або непрямим методом, за допомогою моноклональних антитіл проти IgM людини плюс антимишині антитіла, мічені ферментом. Для виявлення наявності специфічних антитіл до вірусу кору в досліджуваному зразку в реакцію додають субстратхромоген.
Переваги:
- Можливість аналізувати один зразок сироватки крові
- Деякі комерційні набори не мають потенційної небезпеки перехресних реакцій з імуноглобулінами класу IgG
- Чутливість та специфічність даного тесту співпадають з аналогічними показниками для ІФА-тестів, розроблених на основі варіанту ІФА "Подвійний сендвіч".
Недоліки:
- При дослідженні сироваток відібраних в перші 3 дні після появи висипу в 20-30% випадків можуть бути одержані негативні результати
- Некоректні результати можуть мати місце при недостатньому видаленні із сироватки імуноглобулінів класу IgG.
5.4.2.1.3. Непрямий метод ІФА виявлення протикорових IgG антитіл
Принцип методу:
- На твердій фазі адсорбований коровий антиген
- В планшет вносять досліджувані проби сироватки; при наявності в них специфічних антитіл останні зв'язуються з коровим антигеном
- IgG антитіла до вірусу кору виявляють за допомогою коньюгату проти IgG людини
- Наявність специфічних IgG антитіл виявляють за допомогою прямого чи непрямого методу, використовуючи хромогенний субстрат
Переваги:
- Наявність протикорових IgG-антитіл в одній пробі крові вказує на перенесене в минулому захворювання на кір або вакцинацію.
- Метод може бути використаний для проведення сероепідеміологічних досліджень.
- Разом з методами виявлення IgM-антитіл метод виявлення IgG-антитіл може дати додаткову діагностичну інформацію.
- Метод дає можливість кількісної оцінки результатів (в МО/мл, тобто кількісна характеристика в певний момент часу).
Недоліки:
- Для лабораторного підтвердження свіжого випадку кору за допомогою виявлення IgM-антитіл необхідні парні сироватки, одержані в гострій стадії хвороби та під час реконвалесценції.
5.4.2.1.4. Інтерпретація результатів лабораторного дослідження
Заключна класифікація випадків, підозрілих на кір, в країнах де ця інфекція знаходиться у фазі попередження спалахів і елімінації (мал. 1)
- Випадки кору вважають лабораторно підтвердженими, якщо, при використанні сертифікованих тест-систем ІФА, в пробах сироватки крові хворих виявлені JgM-антитіла (позитивні результати) або був підтверджений епідеміологічний зв'язок з хворими на кір
- Випадок розцінюють як підозрілий, якщо позитивні результати лабораторного обстеження були одержані іншими методами, до його лабораторного підтвердження методом ІФА
- Випадок при проведенні епіднагляду класифікується як клінічно підтверджений, якщо сироватка крові хворого на кір не була досліджена на наявність JgM-антитіл методом ІФА з використанням рекомендованих ВООЗ тестів
