---

При дослідженні летких компонентів (з температурою кипіння до 160 град.С) використовують закритий метод (наклейка капсул, годинникового скла та ін.).

Після експозиції ЛФМ видаляють за допомогою ДМСО.

7.3.2. Час одноразової експозиції - 4 години. Повторні досліди проводять протягом двох тижнів по 5 разів на тиждень. Реакцію шкіри оцінюють через 1, 4, 48 та 72 години в дослідах з одноразовим нанесенням, до та після експозиції щоденно при повторних аплікаціях.

7.3.3. Ознаки подразнення шкіри виявляють візуально (почервоніння, наявність тріщин, виразок, крововиливів, набряку, підвищення температури шкіри).

7.3.4. Кількісну оцінку здійснюють на основі вивчення вищеназваних ознак запалення, що є ведучою проявою місцево-подразнюючої дії ЛФМ (його вивчаємих у попередніх дослідах компонентів), шляхом урахування ступеню вираженості еритеми (табл. 7.1.).

Табл. 7.1. Оцінка ступеню вираженості еритеми

------------------------------------------------------------------

|Інтенсивність еритеми візуально |Оцінка в балах |

|-------------------------------------------+--------------------|

|Відсутність еритеми | 0 |

|-------------------------------------------+--------------------|

|Слабка (блідорожевий тон) | 1 |

|-------------------------------------------+--------------------|

|Помірно виражена (рожевий тон) | 2 |

|-------------------------------------------+--------------------|

|Виражена (червоний тон) | 3 |

|-------------------------------------------+--------------------|

|Різко виражена (яскравочервоний тон), | 4 |

|інфільтрація та набряк шкіри | |

|-------------------------------------------+--------------------|

|Яскрава еритема, виражена інфільтрація, | 5 |

|вогнищеві виразки, геморрагії, корочки | |

------------------------------------------------------------------

товщини зморшки шкіри (табл. 7.2.) або інтегральної вираженості шкірно-подразнюючої дії композиції (табл. 7.3.).

Табл. 7.2. Оцінка товщини зморшки шкіри

------------------------------------------------------------------

|Ступінь |Збільшення товщини |Оцінка в балах |

|інтенсивності |зморшки шкіри, мм | |

|набряку | | |

|------------------+-----------------------+---------------------|

|Відсутність |0 |0 |

|------------------+-----------------------+---------------------|

|Слабка |до 0,3 |1 |

|------------------+-----------------------+---------------------|

|Помірна |0,4-0,6 |2 |

|------------------+-----------------------+---------------------|

|Виражена |0,7-1,0 |3 |

|------------------+-----------------------+---------------------|

|Різко виражена |>1,0 |4 |

------------------------------------------------------------------

Табл. 7.3. Інтегральна оцінка подразнюючої дії композиції при одноразовій аплікації

------------------------------------------------------------------

|Вираженість |Сумарний бал |Оцінка, група ризику |

|подразнюючої дії |вираженості еритеми | |

| |та набряку | |

|---------------------+--------------------+---------------------|

|Відсутність | 0 | 0 |

|---------------------+--------------------+---------------------|

|Слабка | 0,1-2,0 | 1 |

|---------------------+--------------------+---------------------|

|Помірна | 2,1-4,0 | 2 |

|---------------------+--------------------+---------------------|

|Виражена | 4,1-6,0 | 3 |

|---------------------+--------------------+---------------------|

|Різко виражена | 6,1-8,0 | 4 |

|---------------------+--------------------+---------------------|

|Надзвичайна | викликає некроз | 5 |

|50% розчин | -"- | 6 |

|25% розчин | -"- | 7 |

|10% розчин | -"- | 8 |

|5% розчин | -"- | 9 |

|<5% розчин | -"- | 10 |

------------------------------------------------------------------

7.3.5. За поріг подразнюючої дії ЛФМ вважають мінімальну його кількість, яка викликає ефект у 50% тварин (для композицій, які віднесені до 1-3 груп). Матеріали, які викликають різко виражене та надзвичайне подразнення шкіри (4,5 групи), відносять до небезпечних при потраплянні на шкіру і їх застосування в побутових умовах має бути обмежено.

7.3.6. Ступінь подразнюючої дії ЛФМ при повторному нанесенні оцінюють за аналогічними показниками при одноразовому нанесенні, але враховують час появи змін, ступінь вираженості і кількість тварин, у яких виявлено реакцію. Компоненти, що викликають інтенсивні пошкодження після 2-5 повторних аплікацій (утворення тріщин, крововиливи, виразки, різко виражена гіперемія та набряк), відносять до сильно подразнюючих.

7.3.7. Для дослідження подразнюючої дії при потраплянні на слизову оболонку очей досліди проводять на трьох дорослих кролях, яким в одне око вводять досліджуваний компонент, а друге служить контролем. Інокуляцію однієї краплі препарату в кон'юнктивальний мішок ока виконують одноразово і контролюють стан слизових оболонок через 15 хв., 1, 24 та 72 години після введення. У випадку, коли з'являються ознаки подразнення або пошкоджуючої дії, ведуть спостереження до повного загоєння.

Оцінку реакції здійснюють в балах, враховуючи всі прояви пошкоджуючої дії (табл. 7.4.)

Табл. 7.4. Оцінка реакції слизових оболонок очей

------------------------------------------------------------------

|Вид пошкодження |Оцінка в |Візуальні ознаки інтенсивності |

|слизових оболонок |балах |показника |

|очей | | |

|------------------+----------+----------------------------------|

|Набряк повік | 0 |Відсутність |

| |----------+----------------------------------|

| | 1 |Слабкий набряк |

| |----------+----------------------------------|

| | 2 |Набряк з частковим вивертанням |

| | |повік |

| |----------+----------------------------------|

| | 3 |Око закрито на половину |

| |----------+----------------------------------|

| | 4 |Око закрито більш ніж на половину |

|------------------+----------+----------------------------------|

|Гіперемія | 0 |Відсутність |

|кон'юнктиви та |----------+----------------------------------|

|рогівки | 1 |Судини ін'єковані |

| |----------+----------------------------------|

| | 2 |Деякі судини важко розрізнити |

| |----------+----------------------------------|

| | 3 |Дифузне глибоке почервоніння |

|------------------+----------+----------------------------------|

|Виділення | 0 |Відсутність |

| |----------+----------------------------------|

| | 1 |Мінімальна кількість в кутку ока |

| |----------+----------------------------------|

| | 2 |Кількість виділень зволожує |

| | |повіки |

| |----------+----------------------------------|

| | 4 |Кількість виділеній зволожує |

| | |повіки та шкіру навколо |

------------------------------------------------------------------

7.3.8. Результати обстеження всієї дослідної групи тварин сумують і роблять заключення про небезпеку ЛФВ при потраплянні на слизову оболонку очей. При різко вираженому пошкодженні ока сумарна кількість балів дорівнює 10.

7.4. Вивчення шкірно-резорбтивної дії

7.4.1. Наявність в рецептурі ЛФМ компонентів, яким притаманні висока розчинність в ліпідах в поєднанні з певною розчинністю у воді, високий ступінь адгезії, в'язка консистенція, потребує вивчення загальнотоксичних ефектів при їх потраплянні на шкіру. На резорбцію компонентів ЛФМ через непошкоджені шкірні покриви можуть також впливати розчинники - в залежності від їх здатності розчинювати плівкоутворюючі чи інші складові рецептури, змінювати проникненість рогового прошарку шкіри.

7.4.2. Оцінку шкірно-резорбтивної дії ЛФМ проводять на білих мишах (хвостова проба), білих щурах (хвостова проба, нанесення на бокову ділянку тулуба) та морських свинках (нанесення на бокову ділянку тулуба). Враховують кожний ймовірний ефект (летальний наслідок, виявлення ознак розвитку інтоксикації за морфологічними, фізіологічними та біохімічними показниками) при проведенні дослідів протягом 4 тижнів.

При позитивному результаті здійснюють другий етап досліджень на білих щурах, за результатами якого визначають клас небезпеки шкірно-резорбтивної дії (табл. 7.5.)

Табл. 7.5 Ступінь небезпеки шкірно-резорбтивної дії

------------------------------------------------------------------

| Найменування | Клас небезпеки* |

| показника |------------------------------------------|

| |1 |2 |3 |4 |

|---------------------+----------+----------+----------+---------|

|Середньо смертельна |<100 |100-500 |501-2500 |>2500 |

|доза при нанесенні на| | | | |

|шкіру, мг/кг | | | | |

|---------------------+----------+----------+----------+---------|

|Шкірно-оральний |<1,0 |1,1-3,0 |3,1-5,0 |>5 |

|коефіцієнт** | | | | |

|---------------------+----------+----------+----------+---------|

|Зона гострої дії при |<6,0 |6,0-18,0 |18,1-54,0 |>54 |

|нанесенні на шкіру | | | | |

------------------------------------------------------------------

Примітки:

* 1 клас - надзвичайно небезпечні; 2 клас - високонебезпечні; 3 клас - помірно небезпечні; 4 клас - малонебезпечні.

** шкірно-оральний коефіцієнт - це відношення LD при

50

перкутанному впливі до LD при внутрішньо шлунковому введенні

50

В простих випадках з цією метою використовують рівняння, що враховують кореляційний зв'язок параметрів токсичності при потраплянні компонентів ЛФМ на шкіру та пероральному шляху введення компонентів ЛФМ:

lg LD перкутан. = 0,79 lg LD в/ш + 0,77 (для білих

50 50

щурів)

lg LD перкутан. (кролі) = 0,645 + 0,54 lg LD в/ш (щурі) +

50 50

0,09 Р, де LD - середньосмертельна доза при введенні в шлунок

50

(в/ш) або на шкіру (перкутан.);

Р - коефіцієнт розподілу октанол-вода.

7.4.3. На підставі експериментально-розрахункового методу автори пропонують наступну класифікацію для оцінки шкірно-резорбтивної дії композицій (табл. 7.6).

Табл. 7.6 Критерії та оцінка ступеню небезпеки шкірно-резорбтивної дії

------------------------------------------------------------------

| Клас небезпеки |LD перкутан. |LD перкутан. |

| | 50 | 50 |

| | |_______________ |

| | | |

| | |LD в/ш |

| | | 50 |

|---------------------+---------------------+--------------------|

|1. надзвичайно |<50 |<0,5 |

|небезпечні | | |

|---------------------+---------------------+--------------------|

|2. високо небезпечні |51-300 |0,6-3,0 |

|---------------------+---------------------+--------------------|

|3. помірно небезпечні|301-2000 |3,1-5,0 |

|---------------------+---------------------+--------------------|

|4. малонебезпечні |>2000 |>5,0 |

------------------------------------------------------------------

За одним з прийнятих оціночних критеріїв визначають клас небезпеки ЛФМ для оцінки ступеню ризику шкірно-резорбтивної дії.

7.5. Сенсибілізуюча дія

7.5.1. Більшості груп ЛФМ (за полімерною основою) та значній частині їх рецептурних компонентів притаманна алергенна активність різної інтенсивності. При застосуванні таких композицій у побуті оцінка цього фактору ризику набуває особливої актуальності - враховуючі, що існує реальна можливість контакту всіх верств населення з потенційними алергенами.

7.5.2 Для оцінки потенційної небезпеки нашкірного шляху потрапляння алергенів спочатку визначають місцево-подразнюючу дію ЛФМ на морських свинках: на попередньо депільовану ділянку тулуба 6 тварин наносять по три краплі ЛФМ (у розведеннях 1:2, 1:10, 1:100) п'ять разів на тиждень протягом двох тижнів. Для попередження утворення нерозчинної плівки, останню видаляють малотоксичним розчинником (ДМСО, етанол, ацетон). Реакцію шкіри враховують щоденно. Ці дослідження необхідні як для виключення ймовірності розвитку дерматиту неалергенного походження, так і для пошуку максимльно недіючої дози, що не викликає контактного неалергенного дерматиту, розвиток якого обумовлено подразнюючою дією ЛФМ.

7.5.3 Первинне вивчення сенсибілізуючої дії незаполімеризованих ЛФМ проводять шляхом комплексної сенсибілізації. Для цього у вушко морської свинки вводять 0,05 мл розчину, що містить 200 мкг препарату. Контрольним тваринам вводять таку саму кількість розчинника. На десяту добу після одноразового введення алергену додатково проводять сім епікутанних аплікацій нативним продуктом або його 50% розчином. Це пов'язано з необхідністю, як правило, збільшити в термін проведення досліджень сумарну дозу алергенних інгредієнтів та активних груп, що входять до складу композиції, тому що доза кожного з них може бути пороговою і, відповідно, недостатньою для розвитку алергічних реакцій.

7.5.4 Виявлення ознак сенсибілізації проводять на наступний день після закінчення епікутанних аплікацій - із застосуванням епікутанних проб та відбору крові для виконання імунологічних тестів.

7.5.5. Для виконання крапельної шкірної проби одну краплю ЛФМ наносять на шкіру середньої ділянки бокової поверхні тулуба тварини. Можна приготувати мазь на основі ланоліну та нанести її на ділянку шкіри розміром 1 х 1 см. Реакцію шкіри оцінюють візуально або за лінійкою Суворова.

7.5.6. Для зниження вартості та прискорення досліджень з виявлення алергенної активності препаратів використовують алергологічні методики на білих мишах (в групах не менше 12 тварин). Сенсибілізацію індукують шляхом введення внутрішньо-шкірно в корінь хвоста стандартної дози (0,6 мг/кг) препарату в об'ємі 0,06 куб.см у суміші з ПАФ. Виявлення сенсибілізації проводять на 5-6 добу за допомогою алергологічних методик in vivo i in vinro.

7.5.7. Виявлення гіперчутливості сповільненого типу проводять за методикою "тест набрякання вуха (ТНВ)". Роздільноздатну дозу препарату наносять по 0,025 куб.см на обидва боки стандартної ділянки вуха сенсибілізованих і контрольних тварин. Результати ТНВ визначають за різницею у товщині вуха, яку вимірюють мікрометром до та через 24 години після тестування. За отриманими даними визначають клас алергонебезпечності ЛФМ (табл. 7.7.).

Табл. 7.7. Критерії та оцінка алергонебезпечності ЛФМ

------------------------------------------------------------------

| Клас | Вираженість ТНВ |

|алергонебезпеки | |

|-----------------+----------------------------------------------|

|1. Сильні |Сенсибілізовано більше 75% дослідних тварин з |

|алергени |вірогідною різницею рівнів показників ТНВ в |

| |досліді і контролі за критерієм X при p < 0,01|

|-----------------+----------------------------------------------|

|2. Виражені |Сенсибілізовано більше 50% дослідних тварин з |

|алергени |вірогідною різницею рівнів показників ТНВ в |

| |досліді і контролі при p < 0,05 |

|-----------------+----------------------------------------------|

|3. Помірні |Сенсибілізовано більше 50% дослідних тварин з |

|алергени |вірогідною різницею рівнів показників ТНВ в |

| |досліді і контролі за критерієм 1 при p < 0,05|

|-----------------+----------------------------------------------|

|4.Слабкі алергени|Сенсибілізовано більше 25% дослідних тварин |

| |при відсутності вірогідної різниці з |

| |контролем |

------------------------------------------------------------------

7.5.8. Про алергенні властивості ЛФМ можуть свідчити також такі неспецифічні показники, як зміна формових елементів білої крові (еозинофілія, лімфоцитоз, моноцитопенія), зміни реакції бласттрансформації лімфоцитів та ін.

7.6. Вивчення гострої пероральної токсичності

7.6.1. Вивчення токсичності ЛФМ при внутрішньо-шлунковому введенні проводять для інтегральної оцінки резорбтивних властивостей ЛФМ експериментально розрахунковим методом.