опустити верхівку тампона у флакон з ВТС і закрити пробірку. Слідкувати за тим, щоб відрізані шматочки або пакувальний матеріал не потрапили у середину пробірки.

Простерилізувати кінчики ножиць у полум’ї (наприклад, на спиртовій горілці, горілці Бунзена чи на будь-якому іншому джерелі вогню). Перед повторним використанням ножиці деякий час охолодити. Якщо процедуру не можна провести вищезгаданим методом необхідно занурити тампон у пробірку, струшувати верхівку тампона у середовищі протягом 30 секунд та притиснути до стінки пробірки до того, як видалити його з середовища та знищити, дотримуючись правил безпеки і використовуючи для цього стерильний пінцет (ця процедура не придатна для зберігання зразків у етанолі).

Мазки із задньої стінки зіву та носоглотки

Мазки із задньої стінки зіву є найкращими зразками, які можна одержати з дихальних шляхів, вірогідність одержати позитивний результат прямо залежить від часу забору матеріалу. Чим раніше одержані мазки з носової порожнини у випадку спорадичного А(H5N1) захворювання, тим більша вірогідність позитивного результату. Однак якщо існують труднощі при одержанні таких мазків (наприклад, від немовлят і дітей молодшого віку), замість них необхідно взяти назофарингіальні мазки.

Мазок із задньої стінки зіву:

притримайте язик шпателем так, щоб він не заважав;

за допомогою поворотних рухів візьміть мазок із задньофарингальної стінки та тонзилярних дужок. Попросіть пацієнта сказати "ааа" щоб підняти язичок. Уникайте контакту з м’яким піднебінням та не торкайтесь кінцівкою тампона до язика (ця процедура може викликати блювотний рефлекс);

помістити мазок у флакон з транспортним середовищем.

Мазок із носоглотки:

увести гнучкий поліефірний тампон на гнучкій рукоятці у ніздрю і глибше у носоглотку. Тампон легше вводити у тому разі, коли голова пацієнта трохи відведена назад. Тампон вводиться через ніздрю до слухової ямки на глибину у 5- у дорослих, щоб досягти задньої стінки зіву (не користуватись тампонами з твердими рукоятками для отримання таких зразків – дуже важливо використовувати тільки гнучкі рукоятки);

залишити тампон після введення на декілька секунд;

повільно, обертовими рухами, вийняти його;

занурити тампон у флакон з середовищем для транспортування;

для другої ніздрі необхідно використати новий тампон і нову пробірку. Це буде другим зразком, взятим у пацієнта.

Увага: одержання назофарингального зразка – це інвазивна процедура, що може викликати значний дискомфорт у пацієнта.

Аспірат із носоглотки

У немовлят та малих дітей цей зразок отримати значно легше, ніж мазок, при цьому використати аспіраційний сифон: увести силіконовий катетер у ніздрю у напрямку слухової ямки та обережно відкачуванням зібрати виділення.

Зразки крові

При отриманні зразків крові та роботі з ними необхідно дотримуватись стандартних застережних заходів у зв’язку з тим, що пацієнт може бути інфікований патогенними мікроорганізмами, що переносяться з кров’ю (наприклад, ВІЛ, гепатитом B чи С).

Користування ЗІЗ.

Зніміть та залишіть для знищення ЗІЗ відразу ж після виконання завдання.

Після кожного зняття рукавичок їх необхідно обробити антисептиком та ретельно вимити руки.

Найкращий «багатосторонній» зразок для забору – це сироватка крові. Сироватка, отримана у гострий період захворювання, та сироватка реконвалесцентів придатні для виявлення змін у титрі антитіл, а також для виявлення вірусної РНК. Сироватку гострого періоду захворювання необхідно взяти якомога швидше після появи клінічних симптомів і не пізніше сьомого дня з часу їх появи. EDTA анти-коагульована плазма крові також придатна для виявлення вірусної РНК у крові і може бути, для цих випадків, навіть придатнішою, ніж сироватка, тому що EDTA інактивує РНК, наявну у зразках. Гепарин у якості антикоагулянту для цих видів зразків непридатний у зв’язку з можливою затримкою ПЛР реакції. Зразки для виявлення вірусної РНК у крові необхідно збирати протягом першого тижня після появи симптомів. Для одержання достатньої кількості сироватки чи плазми для тестування необхідно відібрати не менше 1 мл цільної крові. Це максимальна кількість крові, яку можна взяти у новонароджених. Однак у дітей старшого віку та дорослих зазвичай беруть 3-5 мл крові, що дає можливість провести ширший діапазон досліджень чи повторити дослідження ще раз.

Зразки сироватки у періоді одужання повинні бути зібрані протягом 3-4 тижнів з часу появи симптомів. Коли пацієнт знаходиться в критичному стані, необхідно одержати другий зразок до настання смерті. Для забору крові використовують вакуумну венопункційну систему чи шприци з голками. Зразки необхідно зібрати або в пробірку для сепарування сироватки (ПСС), або в пробірку для згортання крові (для сироватки) та в пробірку з антикоагулянтом EДTA (для плазми).

Необхідно зробити написи на пробірці маркером з нерозчинними чорнилами, зазначивши єдиний реєстраційний номер пацієнта. Зав’язати джгут вище місця взяття крові, за допомогою пальпації знайти вену.

Ретельно обробити антисептиком, 70% спиртом місце ін’єкції (тампоном, змоченим у розчині), змастивши шкіру у центрі ін’єкції та навкруги неї. Почекати щоб антисептичний засіб випарувався. Вену повторно не пальпувати! Взяти кров.

При застосуванні одноразових шприців відбирати 3-5 мл крові дорослої особи чи дитини або 1 мл крові у немовляти. Перенести зразки крові у пробірку та щільно закрити кришечкою.

Якщо відбирається кров за допомогою вакуумної системи (наприклад, Vacutaіner®), необхідно перенести необхідну кількість крові у кожну з пробірок для транспортування.

Зняти джгут. Щільно притиснути стерильним бавовняним тампоном місце венепункції до повної зупинки кровотечі після чого руку пацієнту зігнути.

Гострі інструменти повторно не використовуються. Вони збираються у спеціальні контейнери (у контейнер для знищення гострих інструментів у разі його наявності чи у металевий контейнер з під кави чи подібний; на такий контейнер перед використанням необхідно наклеїти відповідну етикетку).

Повторно перевірити пробірки, що використовуються для зразків, та написи на них.

Після забору всіх зразків, готуються відповідні документи – форми з дослідження випадку, тощо, а також форми, необхідні для лабораторних досліджень, застосовуючи для всіх документів ті ж ідентифікаційні номери, що знаходяться на пробірках.

Сепарація сироватки і плазми

Зразки крові необхідно центрифугувати не менше п’яти хвилин при (3000 обертів за хвилину). Для цього потрібна електрична центрифуга (краще, щоб це була центрифуга з насадкою, що коливається, а не з кутовим ротором). Центрифуги, що приводяться в дію вручну, не використовуються для сепарації сироватки чи плазми з червоних кров’яних тілець.

Пробірки для сепарації сироватки (ПСС)

При використанні цих пробірок необхідно ретельно додержуватись інструкцій для того, щоб отримати бажаний результат.

В пробірках знаходиться гель (з середньою щільністю між клітинами крові та плазмою крові) і (зазвичай) активатор коагуляції.

Перенести зразки крові у пробірку; після цього необхідно діяти згідно з наявними інструкціями для змішування.

Почекати до сформування згустку (процес формування не переривати)

Центрифугувати пробірки згідно інструкції.

Коли заповнена пробірка ПСС пройшла відповідний процес центрифугування, зразок розділиться на три шари – верхній шар сироватки, яка буде відділена бар’єром гелю від самого згустку та активатора коагуляції.

Пробірки для згортання крові

При використанні звичайної пробірки без будь-яких домішок згусток формується за ніч, сироватку можна забрати одноразовою піпеткою наступного дня. Сироватку не слід залишати у контакті із згустком більше 12 годин, тому що після цього може розпочатись руйнування еритроцитів. При використанні будь-якого флакона, як тільки сироватка сформувалась, її необхідно відібрати піпеткою, не доторкуючись до бар’єру з гелю чи згустку. Перенести сироватку у флакон, наприклад у кріофлакон (без ВТС). В ідеальному варіанті флакони для транспортування сироватки повинні мати зовнішні кришечки та внутрішнє кільцеве ущільнення. При відсутності внутрішнього кільцевого ущільнення, перевірити, щоб кришечка була щільно закрита і запечатана інертним герметизатором, наприклад, Parafіlm®.

Пробірки з антикоагулянтом ЕДТА

Центрифугувати пробірки з великою швидкістю (10000 обертів) для осаду клітинної фракції і обережно відібрати плазму піпеткою, не забираючи одночасно клітини крові.

Фільтрувальний папір

Зразки крові чи сироватки можна пересилати у сухій формі на паперових дисках-фільтрах чи спеціальних паперових фільтрувальних смужках (смужки Nobuto). 0,1 мл крові чи сироватки наноситься на смужки і висушується повітряним струменем. Такі смужки можна зберігати місяцями при кімнатній температурі.

Транспортування

Як флакони, так і пробірки із зразками крові необхідно транспортувати у вертикальному положенні у спеціальних контейнерах з кришкою, що закручується, чи у спеціальних штативах у контейнерах. Навкруги пляшечок та пробірок необхідно покласти достатню кількість паперу, що поглинає вологу, в разі проливу рідини.

Зразки від померлих пацієнтів

Якщо у трахею померлого вставлена ендотрахеальна трубка, можна отримати зразок глибокого ендотрахеального аспірату. Якщо дозволяють умови, взяти зразок тканини з ураженої легені за допомогою надрізу чи біопсії. Оператор може скористатися результатами рентгенографії для вибору напряму одержання зразків і націлити на ділянки, що знаходяться на кордоні з інтерстиціальними інфільтратами – найбільш вірогідними місцями репродукції вірусу, для одержання найкращих діагностичних результатів. Зразок легеневої тканини – це найкращий матеріал для різних лабораторних досліджень, включаючи РТ-ПЛР, ізоляцію вірусу, гістологічне дослідження, культуральне бактеріальне дослідження, пряме виявлення антигену чи імуногістохімії та цитокінохемокінічного аналізу. Аспіраційна біопсія дає достатньо матеріалу для мікробіологічного вивчення. Продезінфікувати маленьку ділянку на латеральній поверхні грудної клітки і зробити невеликий розріз стерильним скальпелем між двох ребер, що знаходяться над легенями. Вирізати зразок (зразки) клиновидної форми чи увести у тканину легені голку великого діаметру (наприклад, 18G) і здійснити аспірацію чи відібрати доступний матеріал в голку шприца. Помістити зразок у ВТС. Біопсію необхідно провести якомога скоріше після смерті хворого.

Якщо дозволяє час, необхідні матеріали та міркування з безпеки, можна взяти мазки з зіву, назофарінгальні аспірати чи зразки випорожнень, але цей процес не може викликати затримку взяття зразків глибокого ендотрахеального аспірату чи легеневого матеріалу.

Зберігання зразків

Нижче наведена Таблиця 6 надає перелік можливих умов зберігання та транспортування зразків (на основі вірогідності одержання позитивного результату лабораторного аналізу на вірус грипу А(H5N1)).

Таблиця 6. Придатність різних умов зберігання та транспортування для різних видів зразків.

Умови зберігання/ транспорту-вання

Мазки чи інші зразки у ВТС для ізоляції вірусу

Мазки чи інші зразки у ВТС для ПЛР

Мазки в етаноловому спирті для ПЛР*

Сироватка крові для ізоляції вірусу

Сироват-ка крові для ПЛР

Сироватка крові для визначення антитіл

-70ºC чи сухий лід чи рідкий N2

Настійно рекомендовано

н/в

Настійно рекомендовано

-20ºC

Не рекомендовано

Дозволе-но

н/в

Не рекомендовано

Дозво-лено

Настійно рекомендовано

+4ºC

Дозволено для зберігання на термін до 4 днів

Дозволено

Дозволено для зберігання на термін до 4 днів

Дозволено

Кімнатна температура

Не рекомендовано

Дозволено

Не рекомендовано

Дозволено для зберігання на термін до 4 днів

Висушена крапля крові на фільтрувальному папері

н/в

Дозволено

* При відсутності холодильника

н/в – не використовується

Аліквотні частини зразків (коли один зразок розділяється на декілька пробірок) повинні забиратись до заморожування зразків.

Необхідно запобігати повторному заморожуванню та розморожуванню зразків.

Якщо зразки, розміщені у ВТС (чи сироватці крові, плазмі) для ізоляції вірусу, можуть бути доставлені у лабораторію протягом 4 днів, необхідно зберігати їх при +, а якщо передбачається, що вони будуть зберігатись довший час, необхідно заморозити їх при до того, як їх доставлять у лабораторію. Заморожування при не рекомендовано, тому що вірус погано переносить повільне заморожування до такої температури, і як наслідок результат буде негативним.

При відсутності холодильника (чи ВТС) можливою альтернативою може бути зберігання мазків у етиловому спирті. Краще зберігати такі зразки при + (у стандартних холодильниках), ніж при кімнатній температурі.

Зразки сироватки крові необхідно заморожувати до для ПЛР та до чи нижче для визначення антитіл, хоча їх можна зберігати при + близько чотирьох днів.

Транспортування зразків

При зборі та транспортуванні зразків необхідно використовувати відповідне середовище для транспортування та лід чи рідкий азот. Зразки для визначення вірусу грипу не рекомендується зберігати чи транспортувати у сухому льоді (твердому двоокисі вуглецю) за винятком тих випадків, коли вони запечатані у склі, або запечатані та перев’язані у подвійному пластиковому мішку. Двоокис вуглецю може швидко інактивувати віруси грипу якщо одержить можливість для проникнення в середині пробірки – це може статись у процесі стиснення пробірки у разі замерзання.