_______________
* При подозрении на присутствие психротрофных штаммов С.botulinum, посевы термостатируют при (26±1) °С.
Навески продукта вносят на дно сосуда с питательной средой. Одну из навесок обрабатывают перед посевом этиловым спиртом (96% или абсолютным). Навеску смешивают с равным объемом спирта в колбе с притертой пробкой и, периодически встряхивая, выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Навеску или осадок навески, обработанные спиртом, вносят в питательную среду. Посевы прогревают при температуре и в течение времени, приведенных в табл.4, и помещают в термостат.
5.4.2. Посевы термостатируют, наблюдая за появлением признаков роста микроорганизмов до 14 сут. После появления признаков роста микроорганизмов посевы продолжают выдерживать в термостате 5 сут. Через 5 сут после появления роста микроорганизмов посевы переносят в холодильник и хранят при (4±2) °С.
Развитие С.botulinum в питательных средах начинается со дна пробирки, с помутнения среды, которое равномерно распространяется по всему столбику жидкости, иногда отступая от поверхности на 0,5-1,0 см, и сопровождается выделением пузырьков газа. Видимое газообразование может отсутствовать. Культуральная жидкость издает посторонний запах: гнилостный, сырный, масляно-кислый - от слабо выраженного до явного. С возрастом клетки С.botulinum частично лизируются, часто оседают на дно, и помутнение среды исчезает.
Некоторые штаммы С.botulinum могут переваривать кусочки мяса. При развитии в смешанной культуре те или иные признаки, характеризующие присутствие в культуральной среде С.botulinum, могут отсутствовать.
Непосредственно после появления признаков роста микроорганизмов и затем на 3-и и 5-е сут из посевов отбирают пастеровской пипеткой со дна культуральную жидкость для окраски по Граму, окраски спор, фазово-контрастного микроскопирования и пробы на каталазу по ГОСТ 30425-97. В препаратах устанавливают морфологию бактерий, отмечают наличие типичных клостридиальных клеток, наличие и относительную интенсивность спорообразования и место локализации спор внутри клеток. За 18-24 ч культура С.botulinum образует грамположительные палочки с закругленными концами различной длины и ширины (приложение 1). При старении культуры в ней появляются клетки, не окрашивающиеся по Граму, и спорообразующие клетки обычно в виде ракеток и отдельные споры. Возбудители ботулизма в чистой культуре каталазу не образуют.
После появления признаков роста микроорганизмов пятидневную культуральную жидкость из всех посевов одновременно или последовательно исследуют на присутствие ботулинических токсинов и ботулинических протоксинов по п.5.1.
Исследование начинают с тех посевов, в которых признаки развития С.botulinum выражены наиболее четко; исследование прекращают при обнаружении ботулинического токсина или ботулинического протоксина хотя бы в одном из посевов. В случае необходимости допускается начинать исследование культуральной жидкости раньше, но заключение об отсутствии ботулинического токсина может быть дано только на основании исследования пятидневной культуры.
Обнаружение в культуральной жидкости ботулинического токсина или протоксина и клостридиальных клеток указывает на присутствие в посеве токсигенного штамма С.botulinum. Устанавливают тип обнаруженного токсина или протоксина и тем самым тип С.botulinum, присутствующего в посеве.
5.5. Выделение культур токсигенных штаммов С.botulinum
5.5.1. Выделение культур токсигенных штаммов С.botulinum проводят при получении нечетких результатов по нейтрализации и (или типировании ботулинических токсинов в исходной жидкости).
5.5.2. Культуру токсигенных штаммов С.botulinum выделяют одновременно с (или после) обнаружением ботулинического токсина и (или) мезофильных клостридий в продукте или в культуральной жидкости. Для выделения отбирают те части продукта или те посевы, в которых обнаружены спорообразующие клостридиальные клетки и в которых спорообразование протекало наиболее интенсивно.
Жидкую фазу продукта или экстракт из продукта или культуральную жидкость отбирают пастеровской пипеткой из толщи продукта или со дна пробирки или флакона и по 1-2 см переносят в три стерильные пробирки; продукт или культуральная жидкость первой пробирки предназначены для непосредственного высева на плотные питательные среды, второй - для высева после предварительного прогрева, третьей - для высева после обработки спиртом.
Содержимое второй пробирки прогревают при (60±1) °С или при (80±1) °С в течение 15 мин.
Содержимое третьей пробирки смешивают с равным объемом спирта, укупоривая пробирку так, чтобы во время выдержки спиртовой смеси спирт не улетучивался из пробирки.
5.5.3. Для выделения токсигенных штаммов С.botulinum применяют печеночно-желточный агар, желточный агар для анаэробов или агар кровяной с глюкозой или питательный агар с яичным желтком и лактозой. Продукт или культуральную жидкость отбирают из пробирок пастеровской пипеткой, наносят каплю на поверхность среды и втирают в нее шпателем, получая изолированные колонии. Для этого одним шпателем последовательно засевают три-четыре чашки Петри, перенося посевной материал шпателем из одной чашки в другую. Чашки с посевами термостатируют при (30±1) °С - (36±1) °С в течение 48 ч в анаэробных условиях по ГОСТ 30425-97.
5.5.4. На поверхности плотных сред С.botulinum образует выпуклые или плоские, гладкие или шероховатые, обычно немного расплывчатые колонии с ровными или разрезанными краями. На печеночно-желточном агаре колонии окружены "жемчужной" зоной (кроме типа G), которая повторяет контур колоний; кроме этого, колонии С.botulinum типов А и В имеют обычно узкую, до 2 мм, зону преципитации, типов С, D, Е широкую до 4 мм, зону преципитации. На сахарно-кровяном агаре колонии С.botulinum типов А, В, С, D, Е, F окружены зоной -гемолиза. С.botulinum типа G гемолиза не дает.
Для подтверждения принадлежности выделенных колоний к клостридиям определяют отсутствие каталазы по ГОСТ 30425-97.
Бактериологической петлей из 5-10 колоний, имеющих характерные для С.botulinum свойства, отбирают посевной материал и переносят его соответственно в 5-10 пробирок с питательными средами, посевы термостатируют, устанавливают присутствие в них и тип С.botulinum.
6. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
6.1. Если при проведении биологической пробы хотя бы одна из особей мышей, получившая жидкий продукт, жидкую фракцию или экстракт из продукта, заболела с проявлением клинических симптомов, характерных для ботулинической интоксикации, и остались живы мыши, получившие прокипяченный жидкий продукт, прокипяченную жидкую фракцию или прокипяченный экстракт из продукта, то считают, что в продукте содержится ботулинический токсин.
6.2. Если после предварительной обработки протеолитическим ферментом обнаружен токсин или его количество в продукте увеличилось, то считают, что в продукте содержится ботулинический протоксин.
6.3. Если при проведении биологической пробы все мыши остаются живы, то считают, что ботулинические токсины и протоксины в навеске проанализированного продукта содержатся в количестве менее X-MLD (где X-MLD - минимальное количество токсина, которое можно обнаружить в анализируемом продукте), или отсутствуют.
6.4. Если мыши погибли ранее, чем через 2 ч после постановки биологической пробы с разведенной исходной жидкостью без проявления клинических симптомов ботулинической интоксикации, то указывают, что определить присутствие в анализируемом продукте ботулинического токсина по настоящему стандарту не представляется возможным.
6.5. Если в результате защитного теста или реакции нейтрализации ботулинических токсинов или протоксинов противоботулиническими антитоксическими сыворотками мыши, получившие при постановке биологической пробы только исходную жидкость продукта, а получившие исходную жидкость продукта с моновалентной или двух-, трех- или поливалентной сывороткой, остаются живы, то считают, что в продукте содержится один или несколько ботулинических токсинов или протоксинов.
6.6. Если нейтрализовать и/или типировать ботулинический токсин в продукте и/или в культуральной жидкости не удалось, то указывают, что при проведении биологической пробы мыши погибли с клиническими симптомами ботулинической интоксикации. При этом указывают также типы и концентрации использованных противоботулинических антитоксических сывороток, разведение продукта или культуральной жидкости и раствор, применяемый для получения экстракта продукта.
6.7. Если при типировании ботулинических токсинов или протоксинов мыши, получившие исходную жидкость продукта, погибли с клиническими симптомами ботулинической интоксикации и не погибли мыши, получившие исходную жидкость продукта с противоботулиническими антитоксическими типоспецифическими сыворотками, то считают, что в продукте присутствуют ботулинический токсин или смесь ботулинических токсинов тех типов, которым соответствует сыворотка, нейтрализовавшая токсин и предохранившая животных от гибели.
6.8. Если проводилось титрование ботулинического токсина, то указывают количество (титр) обнаруженного токсина в 1 см или г продукта в единицах MLD.
6.9. При обнаружении в культуральной жидкости посева хотя бы в одной из навесок продукта клостридий и ботулинического токсина или протоксина считают, что в продукте присутствует токсигенный штамм С.botulinum.
Результаты исследования ботулинического токсина в культуральной жидкости посева продукта оценивают аналогично исследованию ботулинических токсинов в продукте.
6.10. Если проводилось выделение токсигенных штаммов С.botulinum, то при обнаружении в посевах хотя бы одной колонии клостридий, способной образовывать ботулинический токсин или протоксин, считают, что в продукте присутствует токсигенный штамм С.botulinum.
При обнаружении в посевах колоний клостридий, не способных образовывать ботулинический токсин или протоксин, считают, что в продукте токсигенные штаммы С.botulinum отсутствуют. Результаты исследования ботулинического токсина в культуральной жидкости выделенного штамма оценивают аналогично исследованиям ботулинических токсинов в продукте.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Обязательное
ТЕРМИНЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В НАСТОЯЩЕМ СТАНДАРТЕ И ПОЯСНЕНИЯ К НИМ
|
Термин |
Пояснение |
|
Исходная жидкость (ИЖ) |
Жидкий продукт или жидкая фаза продукта, или его водный экстракт, или его экстракт в физиологическом растворе, или культуральная жидкость анаэробных посевов, полученные путем отстаивания и центрифугирования и (или) фильтрования продукта в соответствии с настоящим стандартом для исследования ботулинических токсинов |
|
Исходная жидкость, обработанная протеолитическим ферментом (ИЖТ) |
Исходная жидкость, обработанная протеолитическим ферментом трипсином или панкреатином для обнаружения в ней ботулинических протоксинов и определения титра токсинов, полученных в результате такой обработки в соответствии с настоящим стандартом |
|
Ботулинические токсины типов А, В, С, D, Е, F, G |
Комплекс белковых веществ, содержащий высокомолекулярный нейротоксический белок, образуемый С.botulinum типами А, В, С, D, Е, F, G, определяемый с помощью защитного теста или реакции нейтрализации с моно- или поливалентными специфическими антитоксическими сыворотками, и вызывающий заболевание человека, высших млекопитающих и птиц, протекающее с симптомами, характерными для ботулинической интоксикации |
|
С.botulinum |
Клостридии, подвижные палочки с закругленными концами, единичные, парные или в коротких цепочках, образующие овальные субтерминальные, иногда парацентральные споры, обычно вздувающие клетку в виде ракетки или слабо выраженного веретена. В молодой культуре грамположительные. Каталазоотрицательные. Образуют желатиназу; липазу, кроме типа G; способность сбраживать глюкозу, мальтозу и салицин варьируют. Лактозу, сахарозу, маннит нe сбраживают, нитраты не редуцируют, индол не образуют. Углеводы сбраживают обычно с выделением кислоты и газа. Кислота при этом может нейтрализоваться NH , образующимся в процессе разложения С.botulinum азотсодержащих соединений |
|
С.botulinum типы А, В, С, D, Е, F, G |
С.botulinum образующий токсин соответственно типов А, В, С, D, Е, F, G |
|
С.botulinum типы А, В, С, D, F, разлагающие казеин |
С.botulinum, токсины которых нейтрализуются соответственно антитоксическими противоботулиническими сыворотками типов А, В, С, D, F. Клетки 0,8-1,3 4,4-8,6 мкм. Образуют споры без экзоспориума. Разлагают казеин. Сбраживают глюкозу, образуют H S. Салицин, мальтозу сбраживают вариабельно. Не образуют лецитиназу. Оптимальная температура для роста от 30 до 40 °С |
|
С.botulinum типы С, D, не разлагающие казеин |
С.botulinum, токсины которых нейтрализуются соответственно антитоксическими противоботулиническими сыворотками типов С, D. Клетки размером 0,5-0,7 3,4-7,9 мкм. Образуют споры без экзоспориума. Сбраживают глюкозу, иногда мальтозу, салицин. H S не образуют. Оптимальная температура для роста от 30 до 37 °С. Некоторые штаммы образуют лецитиназу |
|
С.botulinum типы В, Е, F, не разлагающие казеин |
С.botulinum, токсины которых нейтрализуются соответственно антитоксическими противоботулиническими сыворотками типов В, Е, F. Клетки размером 0,3-0,7 3,4-7,5 мкм. С.botulinum типы Е, F, образуют споры с экзоспориумом. Споры С.botulinum Е имеют характерные подвески. Сбраживают глюкозу, иногда мальтозу. Отдельные штаммы образуют лецитиназу. Оптимальная температура для роста от 25 до 37 °С |
|
С.botulinum тип G, разлагающий казеин |
С.botulinum, токсин которого нейтрализуется антитоксической противоботулинической сывороткой типа G. Клетки 1,3-1,9 1,6-9,4 мкм. Споры, как правило, не утолщают спорангий. Казеин расщепляется медленно и слабо. Сахара не сбраживает, лецитиназу, липазу не образует, гемолиза не дает. Образует H S. Оптимальная температура для роста от 30 до 37 °С |
|
Морфология колоний С.botulinum типы А, В, С, D, F, гидролизующие казеин, на агаре печеночном |
Колонии d=3-8 мм, округлые с ризоидными краями, плоские с вогнутой серединой, серые, тусклые или слегка блестящие, прозрачные с непрозрачной серединой. Растут одинаково как при наличии, так и в отсутствие сбраживаемых углеводов |
|
Морфология колоний С.botulinum типы В, Е, F, не гидролизующие казеин, на агаре печеночном |
Колонии мелкие и средние, d=1-3 мм, круглые с неправильными выступающими краями, тусклые, полупрозрачные. В присутствии сбраживаемого углевода размер колоний существенно увеличивается |
|
С.botulinum типы С, D, не гидролизующие казеин, на агаре печеночном |
Колонии мелкие и средние, d=1-3 мм, круглые с волнистыми краями, серовато-беловатые, гладкие, тусклые и прозрачные. Присутствие в средах сбраживаемых углеводов не влияет на их рост |
|
С.botulinum тип G на агаре печеночном |
Колонии очень мелкие, d=0,5-1,5 мм, круглые с ровными краями, выпуклые, серые, гладкие, блестящие. Добавление в среду углеводов не влияет на морфологию колоний |
|
Минимальная летальная доза - MLD для мыши |
Минимальное количество токсина, вызывающее в течение 72 ч гибель всех белых мышей массой 15-20 г с характерными клиническими симптомами заболевания при внутрибрюшинном введении в биологическую пробу |
|
Титр токсина в MLD в см или г продукта |
Количество (титр) токсина в 1 г или см продукта, культуральной жидкости или растворов, приготовленных из них, в MLD, вычисляют по формуле |
|
|
, |
|
|
где - разведение исходной жидкости, взятое с обратным знаком; |
|
|
- масса навески продукта, см или г; |
|
|
- объем жидкости, используемый для экстрагирования токсина, см ; |
|
|
- объем жидкости, введенной каждой мыши, см ; |
|
|
- объем исходной жидкости, взятый для приготовления 6 или 4-х кратного разведения, см ; |
|
|
- объем растворителя, взятый для приготовления 6 или 4-х кратного разведения исходной жидкости, см ; |
|
|
ME - международная единица активности ботулинических антитоксинов, соответствующая определенному количеству моновалентной противоботулинической антитоксической сыворотки, способной нейтрализовать определенное количество гомологичного ботулинического токсина |
