Визначення найбільш вірогідного числа мікроорганізмів у воді з використанням тестів діагностичних Quanti-Disc та SimPlate. Методичні рекомендації


МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

Н А К А З

14.03.2008 N 138

Про затвердження методичних рекомендацій "Визначення найбільш вірогідного числа мікроорганізмів у воді з використанням тестів діагностичних Quanti-Disc та SimPlate"

Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" НАКАЗУЮ:

1. Затвердити рекомендовані Комітетом з питань гігієнічного регламентування Міністерства охорони здоров'я України методичні рекомендації "Визначення найбільш вірогідного числа мікроорганізмів у воді з використанням тестів діагностичних Quanti-Disc та SimPlate" (далі - методичні рекомендації), що додаються.

2. Департаменту державного санепіднагляду Міністерства охорони здоров'я України довести методичні рекомендації до установ та закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, міністерств та інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.

3. Контроль за виконанням цього наказу покласти на Директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду МОЗ України Пономаренка А.М.

Перший заступник Міністра,

Головний державний

санітарний лікар України

М.Г.Проданчук

ЗАТВЕРДЖЕНО

Наказ МОЗ України

14.03.2008 N 138

МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

"Визначення найбільш вірогідного числа мікроорганізмів у воді з використанням тестів діагностичних Quanti-Disc та SimPlate"

1. Загальні положення

Методичні рекомендації "Визначення найбільш вірогідного числа мікроорганізмів у воді з використанням тестів діагностичних Quanti-Disc та SimPlate" (далі - методичні рекомендації) розроблені на підставі Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення України", Закону України "Про питну воду та питне водопостачання" та постанови Кабінету Міністрів України від 22.06.99 N 1109 "Про затвердження Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні".

Методичні рекомендації встановлюють методи проведення лабораторних досліджень води по визначенню найбільш вірогідного числа мікроорганізмів у воді (кількості гетеротрофних бактерій) - загального мікробного числа з використанням комерційних тестів діагностичних Quanti-Disc та SimPlate виробництва "IDEXX Laboratories", США.

Мета цих методичних рекомендацій наблизити методи контролю якості води за мікробіологічними показниками, що застосовуються в Україні до методів, прийнятих в Європейському регіоні, мінімізувати долю ручної праці, підвищити продуктивність роботи в лабораторіях.

Методичні рекомендації призначені для застосування в лабораторіях установ державної санітарно-епідеміологічної служби України, що здійснюють вибірковий контроль за якістю різних типів вод (як чистих, включаючи воду фасовану, так і забруднених питних, а також води водойм і стічних), а також у лабораторіях інших організацій, акредитованих у встановленому порядку на право проведення контролю безпеки питної води за мікробіологічними показниками; в організаціях, що здійснюють виробничий контроль питної води.

Загальне мікробне число - кількість колонієутворюючих одиниць (далі - КУО) мікроорганізмів (Colony Forming Units - CFU) у 1 куб.см води.

Загальне мікробне число є непрямим показником бактеріального забруднення води, оскільки характеризує загальний вміст мікроорганізмів у воді без їх якісної характеристики.

Оцінка загального числа мікроорганізмів дозволяє визначити чисельність різноманітних груп мікроорганізмів, здатних утворювати колонії на поживному агарі, оцінити рівень мікробного забруднення води. Даний показник чутливий до збільшення у воді легкозасвоюваних органічних речовин, тому динаміка зростання сапрофітної мікрофлори, особливо в порівнянні з її чисельністю у воді, що поступає, характеризує санітарний стан окремих стадій водопідготовки.

Згідно до вимог ДСанПІНу "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", затвердженого наказом МОЗ України від 23.12.96 N 383, зареєстрованого в Міністерстві юстиції України 15.04.97 за N 136/1940 при невідповідності якості питної води нормативам за органолептичними та іншими інтегральними показниками рекомендовано визначення загальної кількості мікроорганізмів при різних температурах інкубації - при (36 +- 1) град. С протягом 24 год. та при (22 +- 1) град. С протягом 48 год. Зростання числа колоній при інкубації (36 +- 1) град. С свідчить про можливе забруднення антропогенною мікрофлорою. Зростання чисельності бактерій, які розвиваються при (22 +- 1) град. С, свідчить про погіршення санітарно-гігієнічного стану системи водопідготовки чи водопостачання. Крім того, різке підвищення цього показника може свідчити про появу джерела забруднення або виникнення умов для вторинного розмноження мікроорганізмів. Визначення цього показника на етапах підготовки води несе суттєву інформацію щодо ефективності технології її очистки та знезараження.

За рекомендаціями ВООЗ (2004) загальне мікробне число слід розглядати, як індикатор ефективності очищення води, поряд з коліформними бактеріями.

2. Визначення найбільш вірогідного числа мікроорганізмів у воді (загального мікробного числа) з використанням діагностичних тестів QUANTI-DISC та SIMPLATE

2.1. Загальна характеристика методів

2.1.1. Тест IDEXX Quanti-Disc Test Kit - тест діагностичний для підрахунку загального мікробного числа (ЗМЧ) Кванті-Діск, призначений для визначення кількості гетеротрофних бактерій у воді, заснований на запатентованій компанією IDEXX технології Multiple Enzyme Technology, що дозволяє виявити життєздатні бактерії в воді за допомогою визначення специфічних ферментів, які властиві виключно цим мікроорганізмам.

Quanti-Disc використовує численні ензимові субстрати, які виробляють блакитну флуоресценцію під дією ультрафіолетового опромінення, при взаємодії з продуктами метаболізму бактерій, що знаходяться у воді.

Зразок засівають на Quanti-Disc, інкубують, а потім проводять облік результатів по кількості лунок, що флуоресціюють в ультрафіолетовому світлі. Кількість лунок, що флуоресціюють, відповідає Найбільш Вірогідному Числу (НВЧ) всіх бактерій у досліджуваному зразку.

Результати дослідження із застосуванням Quanti-Disc методу, за даними розробників, співпадають з класичним методом глибинного посіву на агарове середовище, інкубації при (36 +- 2) град. С, протягом (48 +- 4) години або (22 +- 2) град. С протягом 68 годин, як описано в стандартах ISO 6222.

2.1.2. Тест IDEXX SimPlate for HPC - тест діагностичний для підрахунку загального мікробного числа (ЗМЧ) - СімПлайт використовується для підрахунку загального мікробного числа у воді. Грунтується на запатентованій IDEXX Технології множинних ензимів, яка визначає живі бактерії у воді по присутності специфічних ферментів, властивих даним мікроорганізмам. При метаболізмі, використовуючи багатокомпонентний ензим-субстрат як поживне середовище, мікроорганізми утворюють продукти, що викликають флуоресцентне свічення під дією ультрафіолетового опромінення.

Зразок і середовище рівномірно поміщають на SimPlate, потім інкубують і проводять підрахунок лунок, що флуоресціюють. По кількості лунок, що флуоресціюють, за допомогою таблиць Найбільш Вірогідного Числа визначається загальне мікробне число в досліджуваній пробі.

2.1.3. Результати досліджень реєструють у робочих журналах встановленої форми.

2.1.4. Враховуючи ідентичне призначення тестів, лабораторії в практичній роботі можуть застосовувати один з зазначених діагностичних тестів, який на їх думку найбільш зручніший і економний. В необхідних випадках арбітражним методом є класичний бактеріологічний метод з підрахунком колоній, що виросли, відповідно до чинної нормативної документації.

2.1.5. Хлоровані проби води необхідно обробляти тіосульфатом натрію під час забору.

2.1.6. Утилізація залишків досліджуваних проб, відпрацьованих діагностичних тестів Quanti-Disc, SimPlate та середовищ проводиться відповідно до вимог Державних санітарних правил ДСП 9.9.5.-080-2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю"

2.1.7. Діагностичні тести Quanti-Disc та SimPlate після закінчення терміну придатності використанню на підлягають.

2.2. Переваги методів QUANTI-DISC та SimPlate

- Стандартизація процесу санітарно-бактеріологічного дослідження води.

- Підвищення достовірності результатів дослідження. Виключення суб'єктивного фактору при оцінці результату.

- Зниження собівартості досліджень і рівня ручної праці в лабораторіях (виключення матеріальних та трудовитрат на миття, підготовку та стерилізацію лабораторного посуду, виготовлення, стерилізацію і перевірку поживних середовищ, підготовку проб до дослідження).

Не потребує виготовлення поживних середовищ в лабораторії.

2.3. Реєстрація в Україні. Тести діагностичні для визначення кількості гетеротрофних бактерій у воді Quanti-Disc та SimPlate зареєстровані в Україні, внесені до Державного реєстру медичної техніки та виробів медичного призначення України і дозволені до використання в медичній практиці згідно з наказом Державної служби лікарських засобів та виробів медичного призначення від 26 жовтня 2007 року N 104 Свідоцтво про державну реєстрацію N 7076/2007.

3. Загальні вимоги до відбору проб води

3.1. Відбір та зберігання проб води для мікробіологічних досліджень проводять згідно діючої нормативної документації.

3.2. Відбір проб проводить спеціаліст після проходження інструктажу з техніки відбору проб для мікробіологічного дослідження.

3.3. При відборі проб в одній і тій же точці для різних цілей першими відбираються проби для мікробіологічного дослідження.

3.4. Для відбору проб води використовують спеціально призначений для цих цілей одноразовий посуд або ємкості багатократного застосування, виготовлені з матеріалів, що не впливають на життєдіяльність мікроорганізмів. Ємкості повинні бути оснащені пробками, що щільно закриваються (силіконовими, гумовими або з інших матеріалів), і захисним ковпачком (з алюмінієвої фольги, щільного паперу). Багаторазовий посуд, зокрема пробки, повинні витримувати стерилізацію сухим жаром або автоклавуванням.

3.5. Пробу відбирають в стерильні ємності місткістю не менше 500 куб.см з дотриманням правил стерильності. Флакон відкривають безпосередньо перед відбором, видаляючи пробку разом із стерильним ковпачком. Під час відбору пробка і краї місткості не повинні чого-небудь торкатися. Обполіскувати посуд забороняється.

Води відбирають стільки, щоб не замочити пробку під час транспортування. Якщо пробка замочилася, то це обов'язково відмічають у супроводжувальних документах (Акт відбору проб води - форма N 323/о, затверджена наказом МОЗ України від 11.07.2000 N 160 "Про затвердження форм облікової статистичної документації, що використовується в санітарно-епідеміологічних закладах", Направлення на санітарно-мікробіологічне дослідження - форма N 205/о, затверджена наказом МОЗ України від 04.01.2001 N 1 "Про затвердження форм медичної облікової документації, що використовується в лабораторіях лікувально-профілактичних закладів") та у Журналі реєстрації санітарно-мікробіологічних та санітарно-паразитологічних досліджень - форма N 379/о, затверджена наказом МОЗ України від 11.07.2000 N 160.

3.6. При дослідженні води з розподільних мереж відбір проб з крана проводять після попередньої його стерилізації обпаленням і подальшого спуску води не менше 10 хвилин при повністю відкритому крані. Якщо відбирають воду після знезараження хімічними реагентами, то для нейтралізації залишкової кількості дезінфектанту в ємність, призначену для відбору проб, до стерилізації вносять натрій сірнистокислий у вигляді кристалів або концентрованого розчину з розрахунку 10 мг натрію сірнистокислого у вигляді кристалів чи 2 куб.см його 1,5% розчину на 500 куб.см води.

3.7. Проби, що відібрані, маркують на місці і супроводжують актом відбору та направленням встановленої форми із зазначенням місця, дати, часу відбору, прізвища та посади спеціаліста, який відбирав пробу, мети дослідження та іншої інформації.

3.8. Доставка проб здійснюється в продезінфікованих контейнерах-холодильниках при температурі (6 +- 2) град. С. У холодний період року контейнери повинні бути забезпечені термоізолюючими матеріалами, що забезпечують оберігання проб від промерзання. При дотриманні вказаних умов термін початку досліджень від моменту відбору проб не повинен перевищувати 6 годин.

Якщо проби не можна охолодити, їх аналіз слід провести протягом 2 годин після забору.

При порушенні термінів доставки проб і температури зберігання результати можуть бути недостовірними, тому аналіз проводити не слід.

4. Порядок визначення найбільш вірогідного числа мікроорганізмів (загального мікробного числа) у воді за допомогою діагностичних тестів QUANTI-DISC

4.1. Обладнання та витратні матеріали

Термостат електричний сухоповітряний з автоматичним терморегулятором температур до 55 град. С, що дозволяє підтримувати в камері температуру, що задана, з точністю +-1 град. С.

Стерилізатор паровий (автоклав електричний).

УФ лампа потужністю 6 Ват, 365 нм.

Діагностичні тести Quanti-Disc (номер за каталогом WQDY-200)

або

Діагностичні тести Quanti-Disc (номер за каталогом WQDY-040).

Маркери по склу.

Флакони для відбору проб води.

Контейнери (сумки) для транспортування проб в лабораторію.

Діагностичні тести Quanti-Disc - являють собою стерильний диск з 50 лунками, по яких розподіляється досліджуваний зразок. Для зручності підрахунку диск розділений на сектори.

Комплектація Quanti-Disc: 40 діагностичних тестів (номер за каталогом WQDY-040) або 200 діагностичних тестів (номер за каталогом WQDY-200).

До кожного набору додається таблиця НВЧ та інструкція.

Термін та умови зберігання. Зберігати при температурі +(2-8) град. С. Кінцевий термін зберігання зазначений на упаковці. При температурі (9-25) град. С, кінцевий строк зберігання - 120 діб, дотримуючись дати на упаковці.