СНЕВ - культура клітин нирок ембріону свині
ФІТЦ - флюоресцеїн ізотіоціанат
ПЕГ - поліетіленгліколь
ІАР - імунна асцитна рідина
ІФА - імуно-ферментний аналіз
Головною особливістю клініки арбовірусних інфекцій є відсутність патогномонічних симптомів, у зв'язку з чим вони проходять під різними клінічними діагнозами і варіюють від важких випадків до інапарантних форм, причому останні зустрічаються значно частіше ніж маніфестні. Тому основним критерієм етіологічної діагностики арбовірусних інфекцій є лабораторні дослідження.
При захворюванні людини на КВЕ найбільше уражується нервова система, хоча спостерігаються ураження і інших органів: печінки, серця, нирок, селезінки, лімфатичних вузлів. Період циркуляції вірусу в крові хворого нетривалий, звичайно не перевищує часу гарячкового стану. Вірус виявляють у перші дні гарячки (3-5 день) в крові, в спинномозковій рідині, в мозку померлих. Елімінація вірусу з крові відбувається в процесі активації неспецифічних і специфічних елементів імунної системи.
Імунна відповідь формується у перші дні після контакту вірусного антигену з клітинами імунної системи і залежить від генетичне обумовленої чутливості організму та вірулентності штаму збудника. Імунна відповідь спрямована не тільки проти вільного вірусу, але й проти інфікованих клітин, розшифрування і руйнування яких до формування в них інфекційних вібріонів відіграє велику роль в одужанні хворого на КВЕ. Лімфоцити, яким належить провідна роль у формуванні специфічного імунітету, сенсибілізуються антигенами вірусу. Ступінь сенсибілізації має прямий зв'язок з наступним розвитком патологічного процесу і формою інфекції.
В крові захворілих на КВЕ з'являються специфічні антитіла: першими - імуноглобуліни класу М, які потім поступово заміняються імуноглобулінами класу G. Антитіла, що гальмують гемаглютинацію, нерідко виявляють уже в перші дні захворювання. Їх титр може сягати найвищого рівня на II-III тижні від початку захворювання. У 30-40% випадків високу концентрацію гемаглютинуючих антитіл визначають вже на 1 тижні. В окремих випадках (1-3%) формування антитіл настільки загальмовано, що їх виявляють лише на VI-VII тижні в невисокому титрі.
Комплементзв'язуючі антитіла з'являються дещо пізніше. У більшості випадків на 1 тижні від початку захворювання вони або відсутні, або їх концентрація незначна. У значної частини випадків (до 60%) ці антитіла відсутні аж до IV-V тижня, внаслідок сповільненого їх формування. Найвищі показники накопичення комплементзв'язуючих антитіл визначають на VI-IX тижнях від початку хвороби. Проте, у частини хворих (до 15%) високий титр антитіл цього виду виявляють навіть на 1 тижні.
Віруснейтралізуючі антитіла з'являються в кінці 1-го на початку II тижня. Титр їх підвищується протягом 3-4 тижнів і потім зберігається без змін впродовж багатьох років життя перехворілого. Антитіла, що гальмують гемаглютинацію, як правило, присутні в крові реконвалесцентів декілька років, титр їх знижується поступово, проте іноді різко падає вже в стадії ранньої реконвалесценції. Комплементзв'язуючі антитіла зберігаються в крові перехворілих не так довго: вже за рік після хвороби у 40% реконвалесцентів їх титр може знизитися до рівня, що не визначається, у решти вони можуть бути виявлені протягом різного терміну, майже до 7 років.
В ряді випадків захворювання на КВЕ спостерігається у вакцинованих і природноімунізованих осіб. Відомі випадки повторного захворювання на КВЕ. Недостатня для повного попередження захворювання напруженість імунітету може бути обумовлена властивостями вірусного штаму, кількістю вірусу, що потрапив до організму, тимчасовим послабленням резистентності організму або сукупністю цих факторів. Захворювання на тлі грундімунітету, як правило, перебігають в легшій формі, при чому специфічні антитіла виявляються вже в перші дні хвороби.
Для діагностики КВЕ оптимальним є виділення вірусу від хворого в гострій стадії захворювання і виявлення зростання титру специфічних антитіл (серологічне дослідження парних зразків крові).
Матеріал для вірусологічного та серологічного дослідження. Збір, транспортування, зберігання
Вірусологічному дослідженню підлягає перша проба крові (або плазми) або 10% суспензія згустку крові у фізіологічному розчині, а також спинномозкова рідина. У випадку смерті хворого досліджують суспензії мозкової тканини з різних відділів головного мозку, шийного і грудного відділів спинного мозку.
Серологічними методами досліджують парні сироватки крові: 1-ий зразок крові беруть на 1-2 день звертання за медичною допомогою, до початку лікування специфічними сироватковими препаратами, 2-й зразок - на III-IV тижні від початку захворювання. У випадку відсутності антитіл може бути проведено дослідження 3-го зразка крові, який береться за вказівкою лікаря через півтора-два місяці від початку хвороби.
Кров беруть з вени шприцом в кількості не менше 5 мл і переносять до стерильної пробірки. Для утворення і кращої ретракції згустку кров витримують 30 хвилин при +37 град. C або при кімнатній температурі, після чого обводять згусток стерильною пастерівською піпеткою, центрифугують.
Зразок сироватки направляють до лабораторії в термосі з льодом. Якщо це неможливо зробити в день забору крові, пробірку залишають у холодильнику при температурі +4 град. C і відправляють в лабораторію через добу. В лікувальних закладах, що знаходяться у віддалених від лабораторії районах, сироватку крові необхідно зберігати до відправлення при температурі +4 град. C не більше 7 діб в щільно закритих стерильних флаконах або пробірках.
Сироватку відсмоктують стерильною пастерівською піпеткою з гумовою грушею і зберігають в запаяних ампулах, еппендорфах або кріопробірках з пробками, що загвинчуються. При одержанні проб сироваток або плазми, що призначаються для серологічного дослідження, не можна допускати лізису еритроцитів крові. Для цього перед розливом в ампули або флакони сироватку (плазму) ретельно очищують від домішків еритроцитів за допомогою центрифугування або відстоювання при +4 град. C.
Матеріали, що призначаються для первинного виділення або
реізолювання вірусу, бажано зберігати до моменту дослідження в
холодильниках при - 60 град. C, контейнерах з сухим льодом (CO )
2
або в рідкому азоті. Менш придатний для цієї мети режим зберігання
при - 20 град. C.
Проби сироваток, плазми, спинномозкової рідини перед дослідженням в серологічних реакціях можна зберігати тривалий час (декілька місяців) при +4 град. C або при мінусовій (-18-20 град. C) температурі. Слід враховувати, що внаслідок багаторазового заморожування і розморожування цих проб в них відбувається зниження титрів вірусу і антитіл, що призводить до похибок в результатах дослідження.
На кожний зразок, направлений до лабораторії для серологічного дослідження, заповнюється "Направлення на аналіз" (облікова форма № 200/о) із зазначенням номеру зразка (I, II).
Парні проби сироваток крові повинні досліджуватись одночасно. У зв'язку з цим до поступлення другої проби сироватки лабораторія повинна забезпечити правильне зберігання перших зразків. На ампули або флакони (ємкістю 5 мл) з пробами наклеюють етикетки, на яких зазначають лабораторний номер реєстрації та черговості взяття зразка (I, II, III). Реєстрацію матеріалу, що надійшов на аналіз, проводять у "Журналі реєстрації серологічних досліджень" (Ф. № 259/о). Лабораторіям обласних СЕС доцільно розподілити записи таким чином: відвести декілька сторінок для кожного адміністративного району, а хворих обласного центру записувати в алфавітному порядку, залишаючи кілька сторінок для кожної початкової літери. Така форма запису значно спрощує реєстрацію матеріалу, що надійшов повторно.
Робота, що стосується збору, зберігання, транспортування і вірусологічного дослідження матеріалів від хворих та з природних вогнищ на КВЕ, проводиться при суворому дотриманні режиму, який забезпечує безпеку персоналу (див. "Положення про порядок обліку, зберігання, обігу, відпускання та пересилання культур бактерій, вірусів, рикетсій, грибів, найпростіших, мікоплазм, бактеріальних токсинів, отрут біологічного походження". Міністерство охорони здоров'я СРСР, 1980 р., а також Державні санітарні правила. ДСП. 9.9.5.035.99 "Безпека роботи з мікроорганізмами I-II груп патогенності").
Серологічна діагностика Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА)
РГГА виконується у відповідності до вимог інструкції з постановки цієї реакції. Інструкція додається до набору інгредієнтів для РГГА, що випускає підприємство-виробник. Як доповнення до цієї інструкції необхідно враховувати наступне:
1. Еритроцити від різних гусаків, що використовуються для РГГА, не можна змішувати, оскільки така суміш може давати неспецифічну аглютинацію. Робочу суспензію еритроцитів готують безпосередньо перед застосуванням. Рівномірний тонкий шар еритроцитів, що вистеляє дно лунки мікропанелі по всій кривизні, оцінюють як повну гемаглютинацію (при оцінці за системою "чотирьох хрестів" + + + +). У випадку утворення еритроцитами кільця на менш однорідному або більш тонкому шарі осаду реєструють часткову гемаглютинацію (+ + + або + +). Мінімальна гемаглютинація - осад у вигляді їудзика на тонкому або фрагментованому шарі еритроцитів (+ або +-). При повній відсутності гемаглютинації осад має форму компактного їудзика без ознак оточуючого тонкого шару еритроцитів (-). Результати + + + +, + + + і + + розцінюють як доказ наявності достатньої кількості антигену в даній лунці (позитивна реакція в РГА, негативна реакція в РГГА). Результати +, +- і - розцінюють як негативну реакцію в РГА або позитивну в РГГА).
2. В РГГА антиген використовують в об'ємі 0,2 мл або 0,025 мл (мікротитратор Такачі або автоматична піпетка-дозатор) замість 0,4 мл або 0,05 мл (мікротитратор Такачі або автоматична піпетка-дозатор), які застосовуються при титруванні антигену в РГА. Тому, щоб визначити розведення антигену, яке містить 4 одиниці, в РГГА відраховують від кінцевої крапки титрування антигену не 3, а 4 розведення, а для робочого розведення, яке містить 8 одиниць, - 5 розведень. Тобто, при титрі антигену в РГА 1:320 4 АЕ міститься в розведенні 1:40, 8 АЕ - в розведенні 1:20.
3. При постановці РГГА в об'ємі 0,8 мл робоче розведення антигену повинно містити 8 одиниць в 0,2 мл, при загальному об'ємі 0,1 мл (мікротитратор Такачі або автоматична піпетка-дозатор) - працюють з 4 одиницями антигену в 0,025 мл, тому що титр антигену при роботі малими об'ємами в 2 рази зменшується.
4. Неспецифічні інгібітори гемаглютинації, що звичайно наявні в сироватках, не адсорбуються на каолін, якщо проба дуже гемолізована, контамінована бактеріями, або тривалий час зберігалась при +4 град. C. В таких випадках для усунення інгібіторів застосовують екстрагування ацетоном.
Для цього 1 об'єм сироватки (0,1 мл) розводять фізіологічним розчином в 10 разів (0,9 мл), охолоджують на льоду і додають 12 об'ємів (по відношенню до розведеної сироватки) холодного ацетону (12 мл). Після екстрагування протягом 5 хвилин суміш центрифугують 5 хвилин при 2500 об/хв. і +4 град C. Надосадну рідину обережно (не збовтуючи осад) вилучають. Осад ресуспензують у попередньому об'ємі (12 мл) охолодженого ацетону, енергійно струшують, екстрагують на льоду 1 годину, періодично струшуючи, після чого центрифугують. Надосадну рідину вилучають. Осад висушують під вакуумом при кімнатній температурі. Випаровування ацетону необхідно проводити у витяжній шафі або добре провітрюваному приміщені. Висушений осад розводять буферним розчином з pH 9,0 із набору для гемаглютинації так, щоб одержати розведення сироватки 1:10 (в 1 мл). Розчинення осаду відбувається протягом декількох годин при кімнатній температурі (при періодичному струшуванні) або протягом ночі у рефрижераторі.
При зберіганні сироваток крові при +4 град C впродовж 8-10 місяців неспецифічні інгібітори з гемолізованих і контамінованих бактеріями зразків не вдається усунути навіть обробкою ацетоном. Крім цього, ензиматична діяльність бактерій може спричинити повну деструкцію специфічних антитіл в сироватці. Такі сироватки серологічному дослідженню не підлягають.
5. Обробка сироватки 25% суспензією каоліну частково або повністю вилучає з неї імуноглобуліни класу М, або ранні специфічні антитіла, тоді як екстрагування ацетоном - більш м'який метод обробки. Проте метод вилучення неспецифічних інгібіторів каоліном можна рекомендувати для використання, як більш простий.
6. Титр специфічних антитіл в оброблених для дослідження в РГГА сироватках (в розведенні 1:10) зберігається майже без змін протягом декількох тижнів, якщо сироватки утримувати в добре закритих гумовими корками флаконах або запаяних ампулах.
7. З метою економії інгредієнтів рекомендується проводити обстеження сироваток в РГГА в два етапи: 1) досліджувати всі сироватки в розведенні 1:10, 1:20 і 1:40; 2) сироватки, що пригнічують гемаглютинацію в титрі 1:40, розтитровувати повторно в розведеннях до 1:1280 - 1:2560.
Реакція зв'язування комплементу (РЗК)
РЗК виконують у відповідності до інструкції з підготовки цієї реакції, що додається до діагностикуму, який випускає підприємство-виробник. Як доповнення до цієї інструкції необхідно мати на увазі:
1. рН фізіологічного розчину для РЗК повинно дорівнювати 7,2. В середовищі з неоптимальним рН чутливість реакції знижується. Чутливість і специфічність РЗК в більшості залежить від точності вимірювань при виконанні дослідів і ретельності стандартизації реагентів по відношенню один до другого, особливо при постановці реакції в малих об'ємах. Неточності, що допускаються по відношенню до будь-якого з п'яти компонентів РЗК, призводять до значної сумарної помилки кінцевого результату і неможливості його відтворювання при повторній реакції.
2. Перед початком дослідження будь-якої серії діагностикуму необхідно визначити, чи відповідає його робочий титр зазначеному на етикетці ампули. З цією метою проводять шахове титрування: крім робочого, в досліді використовують розведення антигену в 2 і в 4 рази менше і більше, титрують із більшими розведеннями специфічної сироватки (1:8, 1:16 і так далі до розведення, яке в 2 рази перевищує зазначений на етикетці титр). Контролями до цього тесту є: а) реакція специфічної сироватки (у всіх розведеннях) з нормальним антигеном у розведеннях, що відповідають його робочому титру та в 2 і 4 рази нижчих; б) реакція нормальної сироватки в розведенні 1:8, 1:16 із специфічним діагностикумом в розведеннях, що відповідають робочому, і у 2 і 4 рази нижчих за них; в) контроль специфічної сироватки 1:8, 1:16; г) контроль нормальної сироватки 1:8, 1:16.
