Примечание — Имеющиеся в продаже готовые среды могут показывать существенные изменения значения pH до и после автоклавирования. Однако если используют дистиллированную или деионизированную воду хорошего качества, то получение нужного значения pH до автоклавирования не требуется.
Разливка
Среду разливают в соответствующие контейнеры, имеющие объем, в 1,2 — 3 раза превосходящий объем среды.
Стерилизация
Общие положения
Стерилизацию культуральных сред и реактивов можно выполнять, используя стерилизацию горячим паром (см. 4.3.7.2) или фильтрацией (см. 4.3.7.3).
Определенные среды не нуждаются в стерилизации автоклавированием и их допускается использовать после кипячения. Например, среды для выращивания Enterobacteriaceae, содержащие бриллиантовый зеленый, особенно чувствительны к нагреванию и действию и после кипячения должны быть быстро охлаждены и защищены от сильного света. Также некоторые реактивы допускается использовать без стерилизации (см. соответствующий международный стандарт или инструкции изготовителя).
Стерилизация горячим паром
Стерилизацию горячим паром осуществляют в автоклаве или в специальном аппарате для приготовления культуральных сред. Обычно автоклавирование проводят в течение 15 мин при температуре 121 °С. Для объемов более чем 1000 см3 цикл стерилизации адаптируют соответствующим образом. Во всех случаях следуют инструкциям, данным в стандарте, и инструкциям изготовителей. Работу автоклава контролируют с помощью показаний термопар и индикаторных полосок при типичных условиях, чтобы гарантировать достижение желаемого температурного профиля.
Примечание — Может происходить перегревание, когда в автоклаве стерилизуются большие объемы сред (1000 см3).
Контроль эффективности стерилизации является существенным в приготовлении культуральных сред.
После нагревания следует охлаждать среды способом, предотвращающим выкипание. Это особенно важно для чувствительных сред, например, предназначенных для Enterobacteriaceae, и сред, автоклавируемых в больших объемах.
Стерилизация фильтрацией
Стерилизация фильтрацией может быть выполнена в вакуумных или герметичных условиях. Используют мембраны и фильтровальные элементы с диаметром пор 0,22 мкм. Они должны быть стерилизованы в автоклаве. При приобретении элементов фильтра и мембран в стерильном состоянии при их использовании следуют инструкциям изготовителя. Стерилизуют различные части аппарата фильтрации в собранном или разобранном состоянии в автоклаве в течение 15 мин при температуре 121 °С. Если необходимо, после автоклавирования сборку в стерильных условиях осуществляют в ламинарном шкафу с очищенным потоком воздуха.
Примечание — На некоторых фильтровальных мембранах могут задерживаться белки (такие как антибиотики). Чтобы получать необходимую концентрацию, пользователь должен использовать предварительно увлажненный фильтр.
Мониторинг (слежение)
После автоклавирования, кипячения или фильтрации во всех средах проверяют значение pH, цвет, стерильность и консистенцию.
Приготовление добавок
Коммерческие добавки, содержащие токсические агенты, особенно антибиотики, следует приготовлять с осторожностью, избегая распыления порошка, который может вызывать аллергические или другие реакции у персонала лаборатории. При приготовлении добавок необходимо соблюдать технику безопасности и следовать инструкциям изготовителя. Не допускается использовать добавки с просроченным сроком годности. Например, для рабочих растворов антибиотика срок годности истекает в тот же самый день. При определенных обстоятельствах растворы антибиотика допускается хранить в замороженном состоянии в соответствующих объемах (аликвотах). Не допускается их повторное замораживание после оттаивания. Потенциальная потеря активности вследствие замораживания должна быть обсуждена с изготовителем или определена пользователем.
Подготовка к использованию
Плавление агаровых культуральных сред
Плавление культуральной среды осуществляют, поместив ее в кипящую водяную баню или любым другим способом, дающим идентичные результаты (например, в автоклаве с проходящим потоком пара). Среды, которые ранее были автоклавированы, повторно нагревают в течение минимального времени, чтобы сохранять качество среды. Следует избегать перегрева и удалять среду из водяной бани, когда она расплавилась. Охлаждают расплавленную среду до температуры (47 ± 2) °С в водяной бане с контролем температуры в течение времени до ее использования. Время, необходимое для достижения температуры 47 °С, зависитот вида среды, объема и количества флаконов в водяной бане. Расплавленную среду следует использовать как можно скорее, по возможности, сразу, но не более чем через 4 ч.
Деаэрация культуральных сред
Если необходимо, до использования нагревают культуральную среду в кипящей воде или в потоке пара в течение 15 мин, приоткрыв крышку или пробку; после нагревания крышки или пробки плотно закрывают и быстро охлаждают до необходимой температуры.
Введение дополнительных добавок
Термолабильные (неустойчивые к нагреванию) добавки следует добавлять в среду после ее охлаждения до (47 ± 2) °С. Стерильная добавка перед добавлением кагаровой среде должна быть доведена до комнатной температуры. Холодные жидкости могут привести к образованию геля из агара или сформировать прозрачные хлопья. Все добавки добавляют в среду осторожно и перемешивают до полного растворения, затем наливают в конечные контейнеры, по возможности, максимально быстро, насколько это возможно.
Приготовление и хранение сред в чашках Петри
Разливают агаровую среду в чашки Петри, чтобы получить слой толщиной не менее 2 мм (например, для чашек диаметром 90 мм обычно требуется 15 см3 среды). Чтобы дать агаровой среде охладиться и застыть, чашки Петри, закрытые крышками, помещают на прохладную, горизонтальную поверхность.
Примечание — В течение инкубации будет происходить потеря влажности агаровой среды. Потеря больше, чем 15 % водного содержимого, может в некоторых случаях неблагоприятно влиять на рост микроорганизмов. Факторы, влияющие на потерю воды, включают в себя состав среды, количество среды в чашках, тип термостата (с вентиляцией или без нее), влажность атмосферы в термостате, расположение и количество чашек в термостате и температуру инкубации.
Разлитую и застывшую среду используют немедленно или хранят при условиях, предотвращающих изменение ее состава, то есть в темноте и/или в холодильнике при температуре 4 °С — 12 °С в закрытых контейнерах в течение одной недели или в соответствии с указаниями изготовителя, или указаниями определенного стандарта на конкретный вид исследования. Чашки маркируют, указывая дату приготовления и/или дату истечения срока годности и идентификации. Допускается использовать альтернативные системы кодирования, удовлетворяющие этим требованиям.
Срок годности чашек с разлитой агаровой средой можно увеличить, если хранить их в герметично закрытых полиэтиленовых пакетах. Чтобы избежать появления конденсата, чашки необходимо охладить перед помещением в пакеты. Не допускается подсушивание поверхности агаровых чашек перед хранением в охлажденном состоянии.
До инокуляции твердой питательной среды на поверхность плотной питательной среды чашки подсушивают, предпочтительно с удаленными крышками и с поверхностью агара, повернутой вниз, в сушильном шкафе при температуре от 25 °С до 50 °С или в ламинарном боксе, пока с поверхности агаровой среды не исчезнут капли влаги. Нельзя пересушивать чашки. Чашки с готовой к использованию ага- ризованной средой, приобретенной в продаже, должны храниться и использоваться согласно инструкции изготовителя.
Инкубация в термостате
Чашки рекомендуется ставить в стопки не более чем по 6 шт. в высоту. Следует оставлять пространство для циркуляции воздушного потока, чтобы среда быстро пришла в равновесие с температурой инкубации в термостате настолько, насколько это возможно. Для жидких сред время для достижения температуры инкубации зависит от ряда факторов, например объема, размещения, типов контейнеров, типов термостата. В случае выращивания в анаэробных условиях может оказаться необходимым сложить чашки в стопки, не менее шести чашек в стопке.
Избавление от сред
Контаминированные и неиспользованные культуральные среды следует удалять безопасным способом в соответствии с национальными правилами.
Контроль качества конечного продукта
Контроль качества физических характеристик
Лабораторное тестирование должно включать в себя, как минимум:
показатель РН, измеренный при температуре 20 °С и 25 °С;
количество заполнения и/или толщину слоя;
цвет;
прозрачность/присутствие оптических артефактов;
стабильность/консистенцию/влажность геля.
Микробиологический контроль качества
Контаминация (заражение)
Соответствующее количество от каждой партии должно быть проверено на контаминацию (заражение).
Контрольные микроорганизмы
Набор контрольных организмов должен содержать микроорганизмы только со стабильными характеристиками определенного вида, которые дают надежные результаты оптимальной эффективности с определенными, приготовленными в лаборатории культуральными средами. Контрольные организмы должны, прежде всего, включать культуры, которые являются широкодоступными в коллекциях эталонных культур и являются хорошо охарактеризованными. Хорошо охарактеризованные микроорганизмы, выделенные в лаборатории, допускается включать в набор контрольных микроорганизмов. Их культуральные характеристики должны быть исследованы и зарегистрированы лабораторией. В контрольном наборе должен находиться штамм с атипичными характеристиками. Предпочтительно использовать штаммы, выделенные из пищевых продуктов, хотя не все коллекции культур предоставляют информацию, касающуюся их происхождения.
Контрольные организмы для каждой среды могут включать:
четко положительные штаммы с типичными характеристиками;
слабо растущие положительные штаммы (то есть более чувствительные по происхождению);
биохимически неактивные штаммы, напримердемонстрирующие различные реакции ферментации или флюоресценции;
полностью ингибированные штаммы.
Примечание — Международный комитет по микробиологии и гигиене пищевых продуктов (WPCM) описал утвержденный перечень коллекции штаммов для оценки питательных сред [1].
Готовые к использованию питательные среды и реактивы
Изготовители имеющихся в продаже готовых к использованию культуральных сред, особенно те, которые одобрены ISO 9001 [2] или ISO 9002 [3], имеют программу контроля качества на месте и могут выдавать сертификат качества на культуральные среды, которые они поставляют. При этих условиях пользователь не обязан выполнять обширный объем испытаний приобретенных сред. Необходима только гарантия, что поддерживаются необходимые условия хранения.
Среды, приготовленные из коммерчески доступных сухих (обезвоженных) ингредиентов
Качественные тесты на каждую партию приготовленной среды являются минимальными. Для тех сред, которые не содержат никаких индикаторов или селективных веществ, использование одного положительного контрольного штамма в испытании является достаточным. Для тех сред, которые содержат индикаторы или селективные агенты, должны использоваться штаммы, которые выявляют функцию индикатора или селективности. Для сложных сред, то есть питательных сред с использованием добавок, каждую партию необходимо проверить со штаммами, характеристики которых приведены в 5.2.2. В случае готовых к использованию сред, к которым добавляют ингредиенты, приготовленные в лаборатории, используют тот же принцип для проверки.
Среды, приготовленные из основных индивидуальных компонентов
Рекомендуется, чтобы в дополнение к качественным тестам, описанным в 5.2.4, выполнялись некоторые количественные исследования при использовании методов типа модифицированной методики Майлса и Миера (Miles and Misra) [1] или посева на чашки по спирали, чтобы проследить тенденции качества основных материалов, продуктивность питательной среды и последовательность этапов приготовления сред внутри лаборатории.
Примечание — На практике пищевые продукты могут содержать микроорганизмы, подвергнутые стрессу. В связи с этим необходимо принимать в расчет способность среды оживления таких находящихся под стрессом микроорганизмов. Информацию по методам консервации и поддержанию культуральных сред и коллекций эталонных штаммов см. в приложении В.
Приложение А
(справочное)
Обозначение компонентов культуральных сред в стандартах
по микробиологическому анализу пищевых продуктов и кормов для животных
А.1 Общие положения
С целью гармонизации описания различных ингредиентов в составе культуральных сред в стандартных микробиологических методах ISO/TS 34/SC 9 «Продовольствие и сельскохозяйственные изделия. Микробиология» приняли решение в отношении обозначений для категории компонентов, представленных в пунтах А.2—А.5.
