4.9. Кальций углекислый стерильный
Фасуют от 2 до 100 г углекислого кальция в пробирки, колбы или флаконы и стерилизуют воздухом по ГОСТ 26668-85.
Добавляют к питательным средам, предназначенным для посева в них кислотных продуктов.
4.10. Раствор аскорбиновой кислоты концентрации 50 г/дм готовят по ГОСТ 4517-87 и стерилизуют фильтрованием через мембранный фильтр N 2.
Применяют в качестве восстановителя, связывающего кислород в питательных средах для анаэробных микроорганизмов.
4.11. Раствор лимонной кислоты концентрации 200 г/дм .
20 г лимонной кислоты переносят в мерную колбу, доводят водой объем до 100 см , растворяют и разливают в пробирки или колбы, стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.
Применяют для подкисления питательных сред.
4.10, 4.11. (Измененная редакция, Изм. N 1).
4.12. Кусочки мяса, фарша, мясная вода, мясной отвар
Освобожденное от костей, жира, сухожилий мясо говядины или конины для приготовления мясного отвара режут на мелкие кусочки или для приготовления мясной воды пропускают через мясорубку, заливают водой из расчета 1 дм воды на 500 г мяса и оставляют на ночь в холодильнике. На следующий день смесь мяса с водой медленно нагревают до кипения и кипятят до готовности, периодически помешивая и доливая воду до первоначального объема. Небольшое количество смеси (до 5 дм ) можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания частичек мяса.
Большое количество лучше кипятить в котлах с паровой рубашкой. Для определения готовности смеси фильтруют сначала небольшое количество ее в пробирку через бумажный фильтр; если жидкость прозрачна, кипячение прекращают. Смесь вновь оставляют до следующего дня в холодильнике, рН охлажденной смеси доводят до 7,0-7,2, фильтруют через ткань, отжимая из кусочков мяса или фарша всю жидкость. Мясную воду или мясной отвар и кусочки мяса или фарша стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.
Применяют в качестве компонентов питательных сред.
4.13. Кусочки печени, печеночная вода, печеночные отвар и бульон
Свежую печень освобождают от пленок и жира. Для приготовления печеночного отвара режут на кусочки массой 30-40 г, для приготовления печеночной воды пропускают через мясорубку. Печень заливают водой из расчета 1 дм воды на 500 г печени, выдерживают при температуре от 4 до 8 °С в течение 2 ч и кипятят в течение 20 мин. После кипячения устанавливают рН 7,0-7,2 и вновь кипятят в течение 10 мин. Смесь процеживают через ткань, жидкость используют для приготовления воды, отвара или бульона. Устанавливают рН жидкости 7,0-7,2 и доводят объем жидкости до первоначального. Печеночные воду или отвар стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин. Для приготовления печеночного бульона к печеночной жидкости перед стерилизацией добавляют пептон из расчета 1 г на 100 см жидкости и поваренную соль из расчета 0,5 г на 100 см печеночной жидкости (контролируя рН 7,0-7,2), разливают во флаконы, колбы или пробирки и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.
Кусочки печени разрезают на более мелкие по 1,5-3 г, заливают раствором двууглекислого натрия и кипятят в течение 10-15 мин (не допуская бурного кипения). После этого кусочки печени промывают в дуршлаге под струей водопроводной воды в течение 1 ч и несколько раз дистиллированной водой. Кусочки печени: должны иметь рН 7,0-7,2; значение рН печени контролируют погружением кусочков в индикатор; бромтимоловый синий индикатор должен иметь сине-зеленую окраску. Кусочки печени фасуют в пробирки, колбы или флаконы и стерилизуют при (121±1) °С в течение 20 мин. Применяют в качестве компонентов питательных сред для анаэробных микроорганизмов.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.14. Лакмус водно-спиртовой раствор (лакмусовая настойка), приготовляют по ГОСТ 4919.1-77.
Добавляют в питательные среды для определения способности микроорганизмов к редукции лакмуса.
4.15. Масло вазелиновое
Масло разливают по 20-50 см в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.
Применяют для наслаивания на жидкие питательные среды для анаэробных микроорганизмов.
4.16. Молоко обезжиренное
Молоко доводят до кипения, оставляют на сутки в холодильнике, освобождают от сливок, вторично доводят до кипения, вновь оставляют на 1 сут в холодильнике и вторично снимают верхний слой. Обезжиренное молоко может быть приготовлено путем сепарирования. Обезжиренное молоко разливают в стерильную посуду и стерилизуют при температуре 100 °С в течение 3 сут по 30 мин или однократно при температуре (116±1) °С в течение 20 мин. После стерилизации молоко не должно принимать коричневый оттенок.
Обезжиренное молоко применяют в качестве компонента питательных сред.
4.17. Раствор гидроокиси натрия концентрации 100 г/дм готовят по ГОСТ 4517-87.
Применяют для подщелачивания питательных сред.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.18. Пептонно-солевой раствор, готовят по ГОСТ 26669-85.
Применяют для приготовления разведений.
4.19. Пирогаллол, щелочной раствор, готовят по ГОСТ 4517-87.
Применяют для поглощения кислорода в емкостях, предназначенных для анаэробных микроорганизмов.
4.20. Цитратная плазма крови
5 см свежеполученной крови, взятой из сердца кролика, помещают в центрифужную пробирку с 1 см раствора лимоннокислого натрия концентрации 50 г/дм (5 г лимоннокислого натрия переносят, смывая дистиллированной водой, в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем до метки). Центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин или оставляют на холоде. Плазму отделяют, разводят физиологическим раствором 1:4 и разливают в стерильные пробирки по 0,5 см .
Плазма кролика может быть заменена человеческой. Не допускается использовать плазму крови человека, которому незадолго до взятия крови вводилась глюкоза.
Человеческая плазма не может быть использована, если исследуемая культура выращивалась в атмосфере углекислоты. В обоих случаях происходит угнетение реакции плазмокоагуляции. Допускается использовать сухую цитратную плазму кролика.
Применяют для определения коагулазной способности микроорганизмов.
4.21. Растворы для определения сульфитредуцирующей способности клостридий: сернистокислый натрий - раствор концентрации 10 г/дм , сернокислое железо - раствор концентрации 4 г/дм .
Оба раствора стерилизуют раздельно при температуре (115±1) °С в течение 30 мин.
Добавляют по 5 см каждого раствора в 100 см охлажденной, регенерированной питательной среды для клостридий непосредственно перед посевом.
4.22. Раствор Люголя
2 г йодистого калия растворяют в 5-10 см воды в мерной колбе вместимостью 300 см , добавляя 1 г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного растворения йода и после этого доводят водой объем раствора до метки.
Применяют для контроля степени осахаривания сусла.
4.23. Раствор I-нафтола
5 г I-нафтола, имеющего точку плавления 92,5 °С, вносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доливают этиловым спиртом с объемной долей 96% до метки.
Раствор применяют свежеприготовленным для контроля ацетилметилкарбинола.
4.24. Раствор панкреатина
4 г панкреатина растворяют в 100 см физиологического раствора и оставляют при температуре (4±1) °С на 16-17 ч. Перед применением полученную жидкость фильтруют через плотный бумажный фильтр, а затем через стерилизующую пластинку фильтра Зейтца до получения прозрачной опалесцирующей жидкости. Готовый раствор панкреатина может сохраняться при температуре (4±1) °С в течение двух недель.
Полученный раствор в объеме 0,5 см не должен убивать белую мышь массой 16-18 г при внутривенном введении. При подкожном введении морским свинкам 0,2 см раствора обычно появляется некроз участка кожи размером 0,5х0,5 см.
Раствор применяют для активации протоксина возбудителей ботулизма.
4.25. Растворы и реактивы для окраски по Граму
4.25.1. Основной красящий раствор по Хукеру
2 г кристалл-виолета с массовой долей сухих веществ 85-90% растворяют в 20 см спирта;
0,8 г щавелевокислого аммония растворяют в 80 см воды; растворы смешивают и выдерживают в течение 24 ч при комнатной температуре перед употреблением.
4.25.2. Йодный раствор по Бурке
2 г йодистого калия растворяют в 5-10 см воды в мерной колбе вместимостью 100 см , добавляют 1 г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного растворения йода и после этого доводят водой объем раствора до метки.
4.25.3. Контрастный красящий раствор
0,25 г сафранина растворяют в 10 см спирта и полученный раствор смешивают со 100 см воды.
4.25.4. Допускается использовать: в качестве основного красящего раствора - водный раствор кристаллического фиолетового концентрации 10 г/дм ; в качестве контрастного красящего раствора - водный раствор сафранина Т концентрации 5 г/дм или спиртовой раствор основного фуксина концентрации 5 г/дм .
Спиртовой раствор основного фуксина концентрации 5 г/дм используют для выявления глобул в бациллярных клетках.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.25.5. Для удаления закрепленного основного красящего раствора используют этиловый спирт (при окраске по Хукеру) и ацетон (при окраске водным раствором кристаллического фиолетового).
4.26. Растворы и реактивы для окраски бактериальных спор
5 г малахитовой зелени растворяют в 100 см воды.
Отдельно 0,5 г сафранина растворяют в 100 см воды.
4.27. Раствор соляной кислоты концентрации 36,5 г/дм
Концентрированная соляная кислота имеет плотность 1,18-1,19 г/см .
При плотности концентрированной соляной кислоты 1,18 г/см ее концентрация составляет 427,7 г/дм , поэтому для приготовления 100 см раствора концентрации 36,5 г/дм отбирают 8,5 см концентрированной соляной кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и содержащую 50-70 см дистиллированной воды, а затем раствор доливают до метки дистиллированной водой.
При плотности концентрированной соляной кислоты 1,19 г/см ее концентрация составляет 455,8 г/дм , поэтому для приготовления 100 см раствора концентрации 36,5 г/дм отбирают 8 см концентрированной соляной кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и содержащую 50-70 см дистиллированной воды, а затем раствор доливают до метки дистиллированной водой.
Раствор применяют для подкисления питательных сред.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.28. Смесь реактивов для создания анаэробных условий
Смешивают 1 г пирогаллола, 1 г углекислого безводного калия и 5 г инфузорной земли и фасуют в бумажные пакеты.
Применяют для создания анаэробных условий.
4.29. Физиологический раствор
0,85 г хлористого натрия растворяют в 100 см дистиллированной воды и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.
Применяют для приготовления растворов реактивов.
4.30. Реактив йодокрахмальный, готовят по ГОСТ 4517-87. Бумагу не пропитывают.
Используют в виде раствора для контроля отсутствия нитритов в питательных средах.
4.31. Парафиновая смесь
Растапливают равные количества парафина и вазелинового масла, смешивают и стерилизуют горячим воздухом при температуре (140±1) °С в течение 60 мин.
Применяют для наслаивания на жидкие питательные среды для анаэробных микроорганизмов.
4.32. Дрожжевой экстракт
100 г пекарских прессованных дрожжей нарезают небольшими кусочками и заливают 500 см воды, подобрав посуду для приготовления экстракта с учетом того, чтобы смесь занимала вместимости. Смесь ставят в термостат (сушильный шкаф) при температуре от 58 до 60 °С на 2 сут и встряхивают 1-2 раза в сутки. Конец автолиза устанавливают по полному разжижению дрожжей. Экстракт должен иметь коричневый оттенок и приятный запах.
Добавляют в питательные среды как источник веществ, способствующих регенерации поврежденных микроорганизмов.
4.33. Раствор с объемной долей перекиси водорода 3%
10 см пироксида водорода с содержанием основного вещества 30% (в случае, если пироксид водорода имеет другое содержание основного вещества, то делается пересчет) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см , доводят объем дистиллированной водой до метки.
Раствор применяют для определения каталазной активности.
(Введен дополнительно, Изм. N 1).
5. ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
5.1. Агар Байрд-Паркер
Основа среды: в 1 дм дистиллированной воды вносят 10 г триптона или пептона, 17,9 г хлористого лития 6-водного, 5 г мясного экстракта и 5 см дрожжевого экстракта.
При отсутствии мясного экстракта вместо дистиллированной воды и мясного экстракта используют 1 дм мясной воды или бульона Хоттингера или 1 дм мясо-пептонного бульона.
При использовании мясо-пептонного бульона триптон или пептон в среду не вносят.
Все компоненты, внесенные в 1 дм дистиллированной воды (мясо-пептонного бульона или бульона Хоттингера), нагревают, помешивая до полного их растворения, охлаждают до 50-60 °С. Устанавливают рН 6,8-7,0, разливают в колбы по 90 см и стерилизуют при (121±1) °С в течение 20 мин. К 90 см основы среды добавляют асептически 5 см желточной эмульсии и стерилизованные фильтрованием через мембранный фильтр растворы: 6,3 см раствора глицина концентрации 200 г/дм , 5 см раствора пирувата натрия концентрации 200 г/дм и 1 см раствора теллурита калия концентрации 10 г/дм .
