Приложение 4а
Инструкция
для определения кишечной палочки в смывах с рук работающих, санитарной одежды, технологического инвентаря и оборудования пищевых предприятий методом индикаторных бумажных полосок (для внутриведомственного контроля)
1. Индикаторные бумажные полоски хранятся в полиэтиленовых прозрачных пакетах, уложенных в количестве 20 штук в черный полихлорвиниловый пакет, предохраняющий их от действия солнечного света.
Полоска имеет белый или слегка кремоватый цвет. При неправильном хранении полоска приобретает розовый цвет и непригодна к употреблению.
2. Перед употреблением вынимают полиэтиленовый пакет с индикаторной бумажкой из полихлорвинилового пакета и с перфорированного конца бумажки ножницами разрезают полиэтиленовый пакет. Полоску индикаторной бумажки вынимают из пакета, беря ее за перфорированный конец.
3. Исследование качества санитарной обработки оборудования и инвентаря.
Обследуется площадь не менее 100 см2. Индикаторную бумажную полоску, площадь которой равна 10 см2 смачивают в течение 3 с путем однократного погружения в стерильный физиологический раствор, удаляя излишки влаги прикосновением конца полоски к стенке сосуда с физиологическим раствором. Смоченную полоску, держа за перфорированный конец, 10 раз прикладывают к исследуемой поверхности в разных местах, плотно прижимая ее профламбированным пинцетом.
4. Исследование качества мытья рук.
Влажную индикаторную бумажную полоску укладывают вдоль ладони, плотно прижимая к ней сначала кончики пальцев другой руки, затем всю ладонь, похлопывая ею и перемещая таким образом по бумажке по направлению от кончиков пальцев к запястью. Сняв индикаторную полоску и перевернув, ее укладывают на другую руку, повторив указанный способ.
5. Исследование санитарной одежды, полотенец, ветоши, применяемой для мойки оборудования и инвентаря (с 20 см2 поверхности).
Смоченную в физиологическом растворе индикаторную полоску плотно зажимают с двух сторон частью санитарной одежды, ветоши и т.д.
После проведенных манипуляций полоску индикаторной бумаги вновь помещают в полиэтиленовый пакет, где она хранилась, перфорированный конец удаляют. Пакет тщательно проглаживают, чтобы полиэтиленовая пленка с обеих сторон плотно прилегала к влажной полоске и весь воздух из пакета был удален. Разрезанную сторону пакета плотно зажимают между двумя пластинами или браншами пинцета и запаивают над пламенем горелки. Пакет помещают в термостат в строго горизонтальном положении, во избежание стекания жидкости и инкубируют при 43 °С в течение 18-24 ч, после производят просмотр полосок, не вынимая из пакетов. В случае невозможности просмотра бумажных полосок, их помещают в холодильник.
Красные точки на исследуемых бумажных полосках являются колониями кишечной палочки. Количество колоний указывает на степень обсеменения бактериями группы кишечной палочки в анализируемом объекте и о нарушении санитарного и хлорного режимов при его обработке. При обнаружении роста кишечной палочки санитарную обработку исследованного объекта необходимо повторить с последующим исследованием вышеуказанным методом.
Для проведения исследований предлагаемым методом необходимы следующее оборудование и материалы:
- автоклав,
- термостат на 43 °С,
- спиртовки,
- пинцеты,
- пробирки,
- бутылки для физраствора,
- ножницы прямые,
- холодильник (+4+6 °С),
- индикаторные бумажные полоски, изготовляемые Рижским заводом "Реагент",
- спирт для спиртовок.
Настоящая Инструкция модифицирована на основе метода определения кишечной палочки с помощью индикаторных бумажных полосок в молоке, молочных продуктах и смывах с оборудования, разработанного Всесоюзным научно-исследовательским институтом молочной промышленности.
Н.И.Радченко и В.Я.Лукьянцева (1976), используя указанный метод при обследовании других объектов, отмечают высокую его чувствительность.
Продолжительность исследования при использовании указанного метода сокращается с 48-72 ч до 12-24 ч, что позволяет своевременно выявить некачественную обработку и принять соответствующие меры к устранению источника загрязнения готовой продукции и полуфабрикатов бактериями кишечной группы.
Данный метод может быть применен для определения качества обработки рук, спецодежды работающих, технологического оборудования и инвентаря в консервной, пивобезалкогольной промышленности, а также при производстве маргарина, колбасных изделий и кондитерских изделий с кремом.
Применение данной качественной методики не исключает классического метода определения кишечной палочки.
Ответственность за выполнение требований настоящей Инструкции возлагается на руководителей контрольно-производственных лабораторий.
Исследованиям на кишечную палочку подлежат:
- смывы с оборудования и инвентаря до начала работы и после санитарной обработки;
- смывы с рук, спецодежды до начала работы, после обеденного перерыва и после посещения мест общего пользования;
- полуфабрикаты и сырье без нормативных показателей количественного загрязнения (сиропы, желе незастывшее, яйцепродукты, молоко сгущенное) после предварительного разведения (растворы красителей и др.).
Кратность обследований санитарно-гигиенических смывов:
- с оборудования, инвентаря, рук и спецодежды - 2 раза в неделю, а при ухудшении эпидобстановки - ежедневно;
- сырье и полуфабрикаты - каждая партия, поступающая на предприятие.
Приложение 4б
Наставление по применению систем индикаторных бумажных (СИБ или БИС) для ускоренного определения коли-титра воды
Бумажные индикаторные системы представляют собой полоски или диски хроматографической бумаги, пропитанные соответствующими субстратами и индикаторами, покрытые для стабилизации пленкообразующим полимером - водным раствором поливинилового спирта.
Бумажная индикаторная система с глюкозой представляет собой диск диаметром 0,8- БИС для определения оксидазы - в виде полосок размером х или дисков диаметром 3,5-. Срок годности БИС указан на этикетках (не менее года).
Способы применения
Постановка оксидазного теста с помощью БИС-оксидазы при работе бродильным методом. По 2-3 изолированных колоний каждого типа, выросших на секторах чашки со средой Эндо, снимают петлей и наносят на полоску БИС-оксидазы (полоску помещают в чашку Петри). При положительной реакции на месте нанесения культуры бумажка синеет в течение одной минуты. При отрицательной - цвет бумажной полоски не изменяется. В ряде случаев оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко, особенно при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет. В таких случаях нужно пересеять колонии со среды Эндо на сектор чашки с питательным агаром или на скошенный питательный агар и после при температуре 37??0,5 °С в течение 3-5 ч пробу повторить.
Постановка оксидазного теста с помощью БИС-оксидазы при работе методом мембранных фильтров. Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями переносят пинцетом, не переворачивая, на бумажный диск БИС-оксидазы диаметром 3,5- (по наиболее принятому размеру фильтра), который предварительно рекомендуется смочить стерильной дистиллированной водой. Через 3-4 мин определяют результат. Все посиневшие колонии, а также колонии с синим ободком не относятся к семейству Enterobacteriaceae, их не учитывают. Мембранный фильтр сразу же после четкого проявления реакции переносят обратно на среду Эндо и немедленно (не позднее 5 мин) отсекают оксидазоотрицательные колонии, по 2-3 колонии каждого типа, для определения ферментации глюкозы.
Определение характера ферментации глюкозы
а) На плотной питательной среде (чашечный метод). В чашку Петри тонким слоем наливают 2%-ный щелочной агар pH 7,2-7,8, не ниже 7,2. Подозрительные на кишечную палочку колонии засевают петлей на сектор чашки по ее периферии. На одной чашке могут быть исследованы 6-8 культур. На место посева (площадка около 0,5 см2) накладывают диск с глюкозой. Для улавливания газообразования и фиксации диска последний заливают несколькими каплями расплавленного и остуженного до 40-45 °С полужидкого агара (0,6-0,8%). Инкубируют при температуре 37??0,5 °С. При разложении глюкозы до образования кислоты цвет диска меняется из красного в желтый. При наличии газообразования пузырьки газа скапливаются по краям диска и между диском и агаром. Результаты учитывают в течение 3-5 ч. Скорость реакции зависит от посевной дозы и ферментативной активности культуры. После 5-6 ч учитывать результаты реакции в ряде случаев затруднительно, так как спустя этот срок начинается подщелачивание среды за счет протеолиза белков, желтая зона вновь розовеет и приобретает первоначальный красный цвет.
В качестве контроля необходимо использовать диск без посева культуры. Красный цвет их не меняется. Различие в цвете контрольных и опытных дисков служит для сравнения при учете реакции.
б) В жидкой питательной среде (пробирочный метод). В пробирку с предварительно розлитым по 0,3-0,5 мл и подогревом до 37 °С питательным бульоном (pH 7,4-7,8) вносят петлей колонию изучаемой культуры и погружают диск с глюкозой. Среда в пробирках в результате быстрой диффузии в нее индикатора, импрегнированного в бумаге, становится красной. При ферментации глюкозы через 3-5 ч инкубации в термостате при температуре 37??0,5 °С среда приобретает желтый или оранжевый цвет, а у газообразующих культур на ее поверхности появляются пузырьки газа. Желтый или оранжевый цвет среды, как правило, сохраняется в течение 18-24 ч, пузырьки же газа к этому времени исчезают. В случае необходимости учета результатов на следующий день рекомендуется использовать погружение в среду небольшого клочка гигроскопической ваты или поплавок. Чем больше засеяно культуры, тем быстрее происходит ферментация глюкозы.
При определении индекса кишечных палочек выявление ферментации глюкозы является решающим, поэтому получение ответа через 4-5 ч вместо 18-24 ч имеет несомненное практическое значение.
Примечания.
1. Исследование проводят с чистой культурой.
2. Аппликацию дисков с глюкозой на чашки или погружение их в пробирки производят обожженным пинцетом.
3. Критерием правильности учета реакций должны быть четкие различия в окраске по сравнению с контролем.
4. Для определения активности оксидазы можно использовать тот же сектор чашки, на котором изучается ферментация глюкозы. Дополнительный посев культуры при этом рекомендуется проводить на участке сектора, расположенного ближе к центру чашки.
5. Основные дефекты при применении БИС с глюкозой зависят от несоблюдения режима pH при использовании посуды, обработанной различными порошками и недостаточно отмытой, несоответствия фактических данных pH физиологического раствора, сухих сред с указанными на этикетках и т.п.
6. Для ускоренного получения результатов необходимо соблюдение стабильного температурного режима термостата (37??1 °С).
Срок годности СИБ - 2 года.
Выписка из ТУ 42.14.123-78.
