- Розчин версену.
- Розчин трипсину 0,25%.
- Розчин Хенкса, рН 7,0.
- Середовище RPMI -1640, рН 7,3.
- Середовище Ігла ДМЕМ для культури клітин, рН 7,2.
- Середовище Ігла МЕМ для культури клітин, рН 7,2.
- Середовище Ігла, рН 7,2.
- Сироватка великої рогатої худоби без консерванту, виробництва
- Сироватка теляча ембріональна без консерванту.
- Спирт етиловий ректифікований.
- Фільтр типу Петрянова.
- "Набор для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды в системе децентрализованого хозяйственно-питьевого водоснабжения поверхностных и сточных вод", производства ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ Республики Беларусь, г. Минск, тел./факс (375017) 2-26-52-63, ТУ РБ 100558032.047-2001, Регистрационное удостоверение N ИМ-7 1705.
Додаток 2
до пп. 8.1.5, 8.2.3,
8.3.2, 8.4.2
Методичних вказівок
ПЕРЕЛІК
устаткування ПЛР-лабораторії
Для обробки матеріалу і виділення НК:
1. Бокс біологічної безпеки II класу.
2. Центрифуга клінічна для пробірок об'ємом 5-100 мл.
3. Центрифуга - вортекс.
4. Мікроцентрифуга від 12 до для мікроцентрифужних пробірок об'ємом 1,5 мл.
5. Твердотільний термостат для пробірок об'ємом 1,5 мл діапазоном робочих температур 25-100 град. С.
6. Набір автоматичних піпеток змінного об'єму (мінімум 3 піпетки: до 20 мкл, до 200 мкл і до 1000 мкл).
7. Одноразові поліпропіленові мікроцентрифужні пробірки з кришками, що загвинчуються або щільно закриваються, об'ємом 1,5 мл.
8. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму до 200 і до 1000 мкл.
9. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму з аерозольним бар'єром до 20, 200 і до 1000 мкл.
10. Штативи для наконечників та мікро пробірок об'ємом 1,5 мл.
11. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
12. Посуд з дезінфікуючим розчином.
Для приготування ПЛР-суміші і проведення ампліфікації:
1. Настільний ПЛР- бокс з бактерицидною лампою.
2. Ампліфікатор (термоциклер).
3. Набір автоматичних піпеток змінного об'єму (мінімум 3 штуки).
4. Одноразові поліпропіленові пробірки для ампліфікації об'ємом 0,5 або 0,2 мл (в залежності від марки ампліфікатора).
5. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму з аерозольним бар'єром до 20 та 100 мкл.
6. Штативи для наконечників та мікро пробірок на 0,5 або 0,2 мл.
7. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
8. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
9. Детектор флюоресценції типу "Джин" (при необхідності).
Для електрофоретичного аналізу продуктів ПЛР:
1. Камера для горозинтального електрофорезу.
2. Джерело постійного струму з напругою 150-460 В.
3. Транс ілюмінатор з кабінетом або камерою для перегляду гелів.
4. Відеосистема з цифровою відеокамерою для реєстрації результатів.
5. Комп'ютер для аналізу результатів електрофорезу.
6. Мікрохвильова піч для плавлення агарози.
7. Колба конічна з термостійкого скла для плавлення агарози об'ємом 250 мкл.
8. Мірні циліндри об'ємом та 100 мл.
9. Штатив для мікропробірок на 0,5 мл.
10. Окрема автоматична піпетка до 20 мкл.
11. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму до 20 мкл в штативі.
12. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
13. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
Для гібридизаційно-ферментної детекції продуктів ПЛР:
1. Термостат планшетний, що підтримує температуру 37 град. С.
2. Вошер (не обов'язково).
3. Планшетний спектрофотометр.
4. Комп'ютер (повинен бути зв'язаний через комп'ютерну мережу з комп'ютером, розташованим у чистій зоні і призначений для аналізу результатів гібридизації).
5. Вісьмиканальна піпетка до 200 мкл.
6. Окремий набір одно канальних автоматичних піпеток змінного об'єму.
7. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму.
8. Мірний циліндр об'ємом .
9. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
10. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
Додаток 3
до п. 6.4
Методичних вказівок
ОДЕРЖАННЯ ГЕЛЮ БЕНТОНІТА
Шматки сухого бентоніту (наприклад, Курцівського родовища) диспергують у п'ятьох об'ємах дистильованої води (вага : об'єм). Для переходу бентоніту в натрієву форму до суспензії додають вуглекислий натрій (вуглекислий натрій ДСТ 4201-66) до концентрації, витримують 1 день при кімнатній температурі і кип'ятять на невеликому вогні при помішуванні впродовж одної години. Центрифугують 10 хв. при 2000 об./хв., надосадову рідину видаляють, осад суспендують у потрійному об'ємі дистильованої води в гомогенізаторі типу РТ-2. Центрифугують 15 хвилин при 2000 об./хв. Сама нижня частина осаду, що складається із забруднюючих речовин, відділяється. Інший осад тричі відмивають у потрійному об'ємі дистильованої води протягом 10 хвилин при 2000 об./хв. Відмитий бентоніт заливають 20 об'ємами дистильованої води (стосовно вихідної ваги матеріалу) і струшують у шуттель-апараті 2 години, потім суспензію центрифугують 10 хвилин при 1000 об./хв. Осад, що складається з грубих часток бентоніту і забруднюючих речовин, видаляють. Надосадову рідину (мілкодисперсну фракцію) центрифугують протягом 30 хвилин при 2000 об./хв., при цьому бентоніт седиментується. Осад, крім самої нижньої частини, що містить забруднюючі компоненти, суспендують у розчину NaCl (хлористий натрій ДСТ 4233-6) і знову осаджують при 2000-3000 об./хв. протягом 30 хв. Фракціонування повторюють тричі, видаляючи саму нижню частину осаду. Після третього центрифугировання осад, що представляє собою мілкодисперсну фракцію бентоніту, суспендують у бідистильованій воді до одержання 5-6% суспензії гелеподібної консистенції.
Вміст бентоніту в гелі визначають шляхом його висушування в сухожаровій шафі при 105 град. С с наступним зважуванням сухого залишку. Гель стерилізують автоклавуванням при 0,5 атм протягом 40 хвилин. Гель бентоніту зберігає сорбційні властивості по відношенню до ентеровірусів протягом багатьох років збереження при кімнатній температурі.
Додаток 4
до розділів 6, 7
Методичних вказівок
УЛЬТРАФІЛЬТРАЦІЙНА СИСТЕМА МІНІТАН
В основі роботи ультрафільтраційної системи Мінітан лежить принцип тангенціального потоку через ультрафільтраційні чи мікропористі мембрани. Під дією перестальтичного насосу розчин переходить із резервуару, що знаходиться під атмосферним тиском в корпус із системи Мінітан із швидкістю 100-1000 мл/хв. Зконцентрована фракція повертається в резервуар, а фільтрат збирається в окремому приймачі. Для концентрування вірусів, білків і клітин потрібно вихідний об'єм до в залежності від бажаного ступіня концентрації.
Завдяки особливостям конструкції пакетика, що має вигляд стопки фільтрів із сепараторів, утворюється постійний плавний потік фракції, що затримується. При такому способі фільтрації відбувається відмивання матеріалу з фільтра за допомогою постійного току рідини, направленим взовж його поверхні. Можливе використання 60 кв.см або 6000 кв.см.
Фірма "Sartorius"
Метод концентрування вірусів у пробах води.
1. Концентрація в системі Sartokon-Mini з модулем (межа відсічення 30 кДа) при пробі V = 3000 мл до V = 400 мл. Час концентрувння - 5 хв.
2. Концентрування на ультраячейці SM 16667 при пробі V = 400 мл, концентрація до V = 1 мл за час 10 хв.
3. Регенерація системи - 20 хв.
4. Загальний час концентрація однієї проби, включаючи регенерацію, 35 хв.
Додаток 5
до розділів 6, 8
Методичних вказівок
МЕТОД
оцінки ефективності концентрації вірусів ("Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. ВОЗ-2003")
Оскільки в кожному алгоритмі дослідження проб води представлені кілька методів концентрації вірусів, то перед тим як вибрати той метод, який планується застосовувати в лабораторії з урахуванням її можливостей та досвіду персоналу необхідно провести оцінку його придатності, тобто атестувати метод в лабораторії. Для цього відому кількість вакцинного поліовірусу типу I (штам Себіна) змішують з відібраною пробою стічної води, далі концентрують вірус із проби тим методом, що планується застосовувати, та визначають кількість поліовірусу типу I в концентраті (елюаті).
Порядок проведення дослідження
1. Готують стандартну серію 10-кратних розведень
вірусовмісного культурального матеріалу з відомим титром
інфекційної активності. Далі розраховують розведення вірусу так,
щоб у об'ємі 100 мл та 1 мл містилось по 20 ТЦД вірусу. З метою
50
перевірки визначеного титру та правильності розрахунків проводять
стандартне титрування в культурі клітин мікрометодом та визначають
титр у вірусовмісному культуральному матеріалі, що був взятий для
дослідження, у зразку об'ємом 100 мл та у зразку об'ємом 1 мл.
2. 1 л проби стічної води ділять на 2 рівні частини. До
однієї з них (0,5 л) додають 20 ТЦД вірусу та проводять
50
концентрування одночасно в двох частинах проби води за вибраним
методом.
3. Після деконтамінації концентрату (елюату) з проби, в яку вносили вірус, відбирають 0,9 мл концентрату і готують наступні розведення на підтримуючому середовищі: 0,7 мл концентрату + 1,4 мл середовища; 0,2 мл концентрату + 1,8 мл середовища. Таким чином, отримують розведення концентрату відповідно 1:3 (2,1 мл) та 1:10 (2,0 мл). Матеріал заморожують та зберігають при мінус 20 град. С.
4. У 5 флаконів на 50 мл з культурою клітин Нер-2 або RD та в 1 флакон на 50 мл з культурою клітин RD(A) на сформовані моношари вносять по 0,5 мл деконтамінованого концентрату (елюату) з проби, в яку вносили вірус.
5. У 2 флакони на 50 мл з культурою клітин Нер-2 або RD та в 1 флакон на 50 мл з культурою клітин RD(A) на сформовані моношари вносять по 0,5 мл деконтамінованого концентрату (елюату) з проби, в яку поліовірус I типу не вносили.
6. Культури клітин поміщають у термостат при 37 град. С та інкубують до формування ЦПД.
7. Якщо хоча б у моношарах 2 флаконів із 6, до яких було внесено концентрат з вірусом, проявляється ЦПД, то метод вважається атестованим. Якщо поліовірус не виявляють, то процедуру тестування проводять повторно, починаючи з п. 2, але вже вносять вірус у дозі 100 ТЦД. У цьому випадку метод вважається атестованим, якщо у всіх 6 флаконах, до яких було внесено концентрат з вірусом, проявляється ЦПД.
Додаток 6
до Методичних вказівок
НОРМАТИВНІ ПОСИЛАННЯ
Основою цих методичних вказівок є такі законодавчі та нормативні документи:
1. Закон України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення".
2. ДСанПіН "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання" (затверджено наказом Міністерства охорони здоров'я України від 23.12.96 за N 383, зареєстровано Міністерством юстиції України від 15.04.97 за № 136/1940).
3. Методическое руководство по биотестированию воды. РД 118.02.09.- М., 1991.
4. Методические указания по санитарно-микробиологическому контролю поверхностных водоемов. № 2285-81.
5. Методичні рекомендації по проведенню епідеміологічного і санітарно-вірусологічного нагляду за якістю джерел водопостачання, питної води в системі водопостачання з метою профілактики захворювання гепатитом А та іншими кишковими вірусними інфекціями. № 01-19/12-13.- К., 1982.
6. Методичні рекомендації по застосуванню бентоніту для виявлення ентеровірусів у людини і в навколишньому середовищі. - К., 1986.
7. Методические рекомендации по контролю и оценке вирусного загрязнение объектов окружающей среды. № 4146-86.- М., 1986.
8. Методические рекомендации "Ротавирусная инфекция" - М., 1989.
9. Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды. - М., 1982.
10. Методичні рекомендації "Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції в умовах практичної вірусологічної лабораторії". - К., 2003.
11. Руководство по контролю качества питьевой воды/ Рекомендации. - Т.І. - Женева: ВОЗ, 1994.
12. Методичні рекомендації "Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції". - К., 2002.
13. Методичні рекомендації "Епідеміологія і профілактика ротавірусної інфекції". - К., 2003.
14. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. - Женева: ВОЗ, 2003.
