---

|путей. Является слабым аллергеном |стакан воды | |

-------------------------------------------------------------------------------------------

Методики постановки реакций, характеризующих принадлежность

выделенного штамма стафилококка к виду золотистого стафилококка

I. Определение плазмокоагулирующей активности

Для реакции может быть использована свежеприготовленная или

сухая цитратная плазма крови кролика*. Человеческая плазма менее

пригодна для постановки реакции. В ней могут содержаться

лекарственные препараты, консерванты, антитела, препятствующие

выделению стафилококковой коагулазы.

______________________

* Сухая кроличья плазма изготовляется Минским институтом

микробиологии и эпидемиологии и Ставропольским институтом вакцин и

сывороток.

Для приготовления цитратной кроличьей плазмы у кролика берут

из сердца 8,0 мл крови и вносят ее в пробирку с 2,0 мл стерильного

5 % лимонно-кислого натрия (предварительно лимонно-кислым натрием

смачивают внутренние стенки пробирки). Смесь перемешивают

вращением пробирки и ставят в холодильник. После полного осаждения

форменных элементов крови плазма отсасывается в стерильную

пробирку и пригодна для постановки реакций в течение 1 - 1,5

недель при условии ее хранения в холодильнике при температ. +4

град. C.

При использовании сухой плазмы годными к употреблению

являются только те ампулы, целость которых не нарушена. В каждой

ампуле содержится 1 мл высушенной кроличьей плазмы. Перед

употреблением ампулу вскрывают и добавляют 1 мл стерильного

физиологического раствора для растворения содержимого ампулы.

Растворение сухой плазмы происходит медленно и требует осторожного

помешивания пастеровской пипеткой.

Для реакции применяют плазму в разведении 1:5 в количестве

0,5 мл (на 1 мл плазмы добавляют 4 мл стерильного физиологического

раствора).

Разведенную плазму разливают в стерильные пробирки (без

пробок) по 0,5 мл и в каждую вносят по одной петле 18 - 20 часовой

агаровой культуры стафилококка (или к 0,5 мл плазмы добавляют 0,5

мл 18 часовой бульонной культуры стафилококка).

Контроль реакции ставится с заведомо коагулазоположительной и

коагулазоотрицательной культурой. Кроме того, для исключения

самопроизвольного свертывания плазмы необходимо также ставить

контроль незасеянной плазмы. Пробирки помещают в термостат при 37

град. C и проверяют наличие свертывания плазмы через 3 часа, затем

пробирки вынимают, оставляют при комнатной температуре на 18 - 20

часов. Окончательный учет реакции проводится на следующий день.

Оставлять реакцию в термостате более 3 часов не

рекомендуется, поскольку при длительной инкубации в термостате

может наступить разжижение образовавшегося сгустка за счет

действия фибринолизина. Реакция считается положительной независимо

от степени свертывания плазмы - от небольшого сгустка, взвешенного

в плазме, до полного неподвижного сгустка. Реакция в контроле

должна быть выражена четко: наличие сгустка с культурой

золотистого стафилококка и отсутствие его в 2 других пробирках.

РКП может быть поставлена в ускоренной модификации,

предложенной Ульянищевой Л.Н. и Кучуриным А.В., которая сводится к

следующему: сразу же после обвивки с чашки на скошенный агар

колоний подозрительных на стафилококк, в пробирку добавляется 0,5

мл плазмы в разведении 1:5. Плазму следует добавлять стерильно,

внося ее по стенке противоположной скошенному агару. Пробирки

помещают в термостат при 37 град. C на 18 - 20 часов, после чего

производят учет реакции. Верхняя часть скошенного агара с выросшей

культурой может быть использована в дальнейшем для определения

других свойств выделенного штамма. Для постановки реакции не

рекомендуется использовать свежеприготовленный скошенный агар,

который имеет конденсат, дающий дополнительное разведение плазмы.

Если культура обладает плазмокоагулирующей активностью, то в

пробирке образуется сгусток плазмы. Отсутствие сгустка

свидетельствует об отрицательной реакции плазмокоагуляции. К

каждому опыту необходимо ставить контроли, как отмечено выше.

Опыты, давшие сомнительный результат в контроле, подлежат

повторению. Постановка РНП в ускоренной модификации позволяет на

сутки раньше получить ответ о принадлежности выделенного штамма к

тому или иному виду стафилококка.

II. Определение ДНКазной активности

Для постановки реакции используется 2 % агар на переваре

Хоттингера или приготовленный из сухого питательного агара (pH

8,6). Агар разливают во флаконы по 150,0 мл. По мере надобности

агар растапливают и в него добавляется ДНК (дезоксирибонуклеиновая

кислота) из расчета 2 мг на 1 мл среды. Во флакон, содержащий

150,0 мл среды, следует добавить 300,0 мг ДНК. Предварительно ДНК

растворяют в дистиллированной воде, подщелоченной IN NaOH.

Растворение ДНК в воде без добавления щелочи происходит не

полностью. Агар с добавленной ДНК стерилизуют текучим паром в

течение 30 минут. Стерильная среда может храниться в холодильнике

в течение 1,5 - 2 месяцев. Перед разливом чашек агар растапливают,

добавляют хлористый кальций из расчета 0,8 мг на 1 мл среды (на

150,0 мл среды следует добавить 1,2 мл продажного стерильного 10 %

хлористого кальция). На хорошо подсушенную чашку засевают полоской

от 10 до 20 культур стафилококка. Чашки помещают в термостат при

37 град. C 18 - 20 часов, после чего их заливают 5,0 - 7,0 мл IN

HCl. Учет реакции проводится после 7 - 10 минутного контакта

кислоты со средой, которая перед учетом реакции сливается.

Соляная кислота, реагируя с ДНК, содержащейся в среде,

образует непрозрачный белый преципитат. Если исследуемый штамм

выделяет в среду ДНКаза, то последняя деполимеризует ДНК.

Вследствие этого при обработке соляной кислотой вокруг таких

культур образуется прозрачная зона, содержащая продукты

расщепления ДНК, которые не осаждаются соляной кислотой. Хотя

ширина прозрачных зон вокруг засеянных колоний может быть

различной чашечный метод определения ДНКазной активности является

качественным тестом. При оценке реакции на ДНКаза возможны

следующие варианты:

1. Наличие четкой зоны просветления среды - положительная

реакция.

2. Полное отсутствие зоны просветления среды - отрицательная

реакция.

3. Наличие нечеткой, небольшой зоны просветления среды -

сомнительная реакция. В данном случае реакцию необходимо

повторить.

Определение ДНКазной активности можно проводить не только у

суточных культур, но без предварительного пересева их после 7 - 10

дневного хранения в холодильнике.

В настоящее время показана принципиальная возможность

использования для определения ДНКазной активности не только

высокополимерной ДНК, но и натриевой ее соли, получаемой из

селезенки рогатого скота, производства Олайнского завода

химических реактивов Латвийской ССР.

С целью сокращения расхода ДНК рекомендуется использовать

двухслойный метод определения ДНКазной активности, предложенный А.

А. Трояшкиным. Сущность этого метода заключается в том, что ДНК

вносится лишь в верхний слой среды, налитый в чашку Петри.

Методика постановки реакции:

1. К 100 мг натриевой соли ДНК добавляют 10 мл

дистиллированной воды, 0,5 мл 0,2 N раствора NaOH и осторожно

встряхивают. Пробирку оставляют при комнатной температуре или в

термостате до следующего дня. Для ускорения растворения ДНК

пробирку можно поместить в кипящую водяную баню. Готовый раствор

ДНК имеет вид и консистенцию нативного яичного белка (рабочий

раствор ДНК).

2. В расплавленный 2 % агар (pH 7,2 - 7,4), разлитый в

пробирки по 10,0 мл, добавляют по 1 мл рабочего раствора ДНК и 0,1

мл продажного стерильного 10 % раствора хлористого кальция. Смесь

тщательно перемешивают и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. в

течение 20 минут, или дробно - три дня подряд по 20 минут в

кипящей водяной бане. Агар с ДНК можно хранить 1,5 - 2 месяца в

холодильнике, не допуская высыхания.

3. Чашки с 2 % питательным агаром следует хорошо подсушить.

Столбик агара с ДНК растапливают в водяной бане и выливают

равномерно вторым слоем на агар и ставят на ровную поверхность.

После застывания второго слоя чашки снова подсушивают. Посев

испытуемых культур, режим термостатирования и учет результатов

проводятся как описано выше.

Наличие ДНКазной активности является простым, удобным и

весьма специфическим тестом дифференциации золотистого

стафилококка и эпидермального стафилококка. ДНКазная активность

обнаруживается у 97 - 98 % штаммов золотистого стафилококка.

III. Определение ферментации маннита в анаэробных условиях

Для реакции можно использовать среду, приготовленную из

сухого агара с индикатором ВР, содержащую маннит (пропись см.

ниже). Среду разливают в пробирки по 4,0 мл и стерилизуют. По мере

надобности пробирки со средой регенерируют и добавляют по 2,0 мл

стерильного вазелинового масла. Когда среда остынет, уколом (до

дна) производят посев испытуемой культуры. Пробирки помещают в

термостат при 37 град. C на 5 суток. В случае разложения маннита

среда приобретает синий цвет по всему столбику агара.

Способность разлагать маннит в аэробных условиях

обнаруживается у 94 - 96 % штаммов золотистого стафилококка.

IV. Определение лецитовителлазной активности

При использовании для первичного посева среды, содержащей

желток, специального дополнительного определения лецитовителлазной

активности у стафилококка проводить нет необходимости. В случае

выделения культуры с других сред в необходимости определения у нее

этого признака следует на чашку с ЖСА посеять испытуемую культуру

штрихом или бляшкой. Чашки инкубируют в термостате при 37 град. C

в течение 18 - 20 часов. При положительном результате вокруг

колоний стафилококка образуется радужный венчик, что обусловлено

выделением фермента лецитовителлазы и разложением лецитина,

находящегося в среде. Реакцию следует учитывать в отраженном

свете. Лецитовителлазной активностью обладает 60 - 75 % штаммов

золотистого стафилококка человеческого происхождения и 5 - 10 %

штаммов стафилококка животного происхождения.

V. Определение пигментообразования

Пигмент колоний стафилококка может варьировать от

ярко-золотистого к желтому, кремовому до белого.

Пигментообразование лучше проявляется на свету, при посеве культур

на агар, содержащий 10 % снятого молока.

Следует отметить, что золотистый пигмент образуют не только

золотистый стафилококк; колонии некоторых эпидермальных

стафилококков и микрококков могут иметь аналогичную окраску. В то

же время золотистые стафилококки могут вырастать на агаре в виде

белых колоний.

VI. Определение гемолитической активности

В настоящее время показано, что 60 - 70 % эпидермальных

стафилококков на кровяном агаре образуют четкие зоны гемолиза.

Поэтому определение гемолитической активности штамма не может

служить четким дифференциально-диагностическим тестом для

золотистого стафилококка и эпидермального стафилококка. В случае,

если имеется необходимость определения альфа-гемолитической

активности у выделенных штаммов необходимо использовать 3 - 5 %

кровяной агар, содержащий эритроциты кролика, т. к.

альфа-гемолизин стафилококка не лизирует эритроциты других

животных и слабо лизирует эритроциты человека. Гемолитическая

активность стафилококков животного происхождения может быть

определена на 3 - 5 % кровяном агаре, содержащем эритроциты

барана. Чашки с исследуемыми культурами выдерживают 24 часа в

термостате при 37 град. C и 24 часа в холодильнике при температ.

+4 град. C.

VII. Определение фаготипа золотистого стафилококка

Методика фаготипирования стафилококков подробно изложена в

наставлении по применению типовых стафилококковых бактериофагов,

прилагаемых к Международному набору, выпускаемому ИЭМ им.

Н.Ф.Гамалеи АМН СССР.

Фаготипированию должны подвергаться только золотистые

стафилококки. При этом следует руководствоваться следующими

правилами: золотистые стафилококки, выделенные из верхних

дыхательных путей у персонала родильных домов, должны подвергаться

фаготипированию в обязательном порядке. Золотистые стафилококки,

выделенные от больных, подвергаются фаготипированию по

эпидемическим показаниям.

Для фаготипирования используются Международный набор из 22

умеренных фагов, которые разделены на 4 группы:

I группа - фаги 29, 52, 52А, 79, 80,

II группа - фаги 3А, 84, 3С, 55, 71,

III группа - фаги 6, 85, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А,

IV группа - фаги 42Д,

Вне групп - фаги 81, 187.

При проведении фаготипирования необходимо руководствоваться

следующим:

1. Первым этапом фаготипирования является приготовление

соответствующих разведений фага. К каждой ампуле с высушенным

фагом добавляют по 1,0 мл щелочного бульона Хоттингера, Мартена,

мясо-пептонного бульона (pH 7,6). Поскольку фаги высушиваются в

объеме 0,1 мл, при добавлении 1,0 мл бульона получают разведение

0,001. Если на этикетке ампулы указанное тест-разведение

соответствует 0,001 (1:1000), то для получения разведения фага,