5.5. Матеріал, що надходить для дослідження, приймають в кімнаті прийому, реєстрації, розбору і первинної обробки матеріалу, де його розбирають і сортують дотримуючись вимог біологічної безпеки.
Розпаковування матеріалу проводиться з дотриманням запобіжних заходів, з використанням маски та гумових рукавичок.
Первинні транспортні контейнери або сумки-холодильники, в яких доставлено зразки, після розвантаження, обробляють дезінфікуючими розчинами, після чого вони можуть бути повернені закладу (власнику), що направив матеріал.
Зразки і посуд, в якому матеріал надходить для дослідження, поверненню не підлягають.
Ємкості, що містять матеріал, зовні обробляють дезінфектантом, ставлять на металеві підноси або в штативи і переносять на стіл для реєстрації і сортування.
Зразки біологічного матеріалу реєструють відповідно до форми N 252/о "Журнал реєстрації мікробіологічних та паразитологічних досліджень", затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.2001 N 1; проби з об'єктів довкілля - відповідно до форми N 379/о "Журнал реєстрації санітарно-мікробіологічних та санітарно-паразитологічних досліджень", затвердженої наказом МОЗ України від 11.07.2000 N 160.
Кожний зразок маркують відповідно до реєстраційного журналу.
5.6. При проведенні досліджень методом ПЛР неухильно дотримуються таких правил послідовної обробки матеріалу:
5.6.1. Після реєстрації промарковані зразки передають на робочі місця для підготовки матеріалу для дослідження методом ПЛР, де проводять їх первинну обробку (центрифугування проб, їх об'єднання або розділення тощо).
5.6.2. При перенесенні біологічного матеріалу із флаконів (пробірок) в інші та виконанні маніпуляцій з ним використовують тільки окремі одноразові наконечники з аерозольним бар'єром.
5.6.3. При роботі з біологічним матеріалом важливо не здійснювати різких рухів, обережно відкривати пробірки, флакони, враховуючи можливість аерозольних викидів, які можуть привести до контамінації проб і робочих поверхонь.
5.6.4. Передачу і доставку аліквот проб обробленого і знезараженого матеріалу, препаратів НК, пробірок з продуктами ПЛР із одного приміщення всередині лабораторії в інше здійснюють через шлюзові передаточні вікна або переносять у щільно закритих металевих або пластмасових контейнерах. Контейнери після кожного використання піддають дезінфекції.
5.6.5. У приміщення виділення НК матеріал доставляють тільки в закритих одноразових пробірках у вигляді маркованих аліквот. Після виділення НК передають для постановки реакції у кімнату приготування реакційних сумішей і проведення ПЛР або зберігають у холодильній чи морозильній камері.
5.6.6. У кімнаті приготування реакційних сумішей і проведення ПЛР готують компоненти реакційної суміші та складають власне реакційну суміш (якщо не використовуються готові тест-системи), додають виділені препарати НК. Всі маніпуляції проводять у окремих настільних ПЛР-боксах. Реакційні суміші готують до початку роботи з виділеними НК.
В ПЛР-лабораторіях з невеликим обсягом різноманітних досліджень допускається об'єднати виконання етапу приготування реакційної суміші і внесення виділеної НК в одному ПЛР-боксі в різний час після попередньої обробки ПЛР-боксу.
Перед початком роботи та після її закінчення ПЛР-бокси та обладнання, що в них знаходиться, обробляють 70° C спиртом та опромінюють ультрафіолетом 1 годину.
Усі маніпуляції у ПЛР-боксах, перенесення реакційних сумішей і препаратів НК, заповнення ампліфікаторів пробірками із реакційною сумішшю і НК та звільнення від них проводять в одноразових гумових рукавичках.
5.6.7. При використанні праймерів з флуорофорами - після постановки реакції проводять детекцію, облік та реєстрацію результатів дослідження. Відпрацьовані пробірки з дотриманням вимог підпункту 5.6.4 пункту 5.6 цих Правил видаляють з приміщення, де проводилась ампліфікація, у форезну або спеціально виділене приміщення для первинної дезінфекції відпрацьованого матеріалу, де проводять їх знезараження.
5.6.8. При використанні класичного формату реакції або ГІФА - реакційні пробірки з дотриманням вимог підпункту 5.6.4 пункту 5.6 цих Правил передають у "брудну" зону до кімнати для детекції продуктів ампліфікації для подальшого електрофорезу або ГІФА.
5.6.9. Робота з розчинами, що містять бромистий етидій (гель для електрофорезу, буферні розчини тощо), проводиться в гумових рукавичках (одна або дві пари), оскільки речовина вибірково комплексується з ДНК і має мутагенну та тератогенну дію.
5.6.10. Ультрафіолетове опромінення, що застосовується для візуального обліку результатів електрофорезу, небезпечне для зору, тому необхідно користуватися захисними окулярами, маскою або щитком.
5.6.11. Після проведення детекції і обліку результатів дослідження класичним методом (електрофореграма) або ГІФА пробірки з продуктами ПЛР та використані наконечники до мікродозаторів піддають первинній обробці дезінфікуючими розчинами, що спричинюють деградацію ДНК, дозволеними до застосування в установленому порядку. Процедуру проводять безпосередньо у форезній або спеціально виділеному приміщенні для первинної дезінфекції відпрацьованого матеріалу, яке розташоване як можна далі від "чистої" зони. Остаточне знезараження використаних витратних матеріалів і реагентів проводять в автоклавній кімнаті.
5.6.12. Результати досліджень оформляють і зберігають в ПЛР-лабораторії згідно з підпунктом 3.1.8 пункту 3.1 цих Правил.
5.7. За результатами аналізу видають відповідь про наявність у досліджуваній пробі специфічних ділянок (фрагментів) ДНК або РНК, що мають гомологію з певною ділянкою генома збудника відповідного інфекційного захворювання, або про наявність в досліджуваному матеріалі генетичних маркерів або генетично модифікованої НК.
5.8. При проведенні досліджень суворо дотримуються умов зберігання усіх реагентів згідно з інструкцією (настановою) про застосування наборів. Усі реактиви зберігають розлитими на окремі порції (аліквоти). Не допускається використання реагентів з вичерпаним терміном придатності або таких, що зберігалися у не відповідних умовах.
5.8.1. Серійні аліквоти реагентів повинні бути пронумеровані і занесені в спеціальний журнал з вказівкою номера партії реактивів, з якої проведене аліквотування, дати приготування аліквот і особи, що проводила розлив реагентів.
5.8.2. Перед роботою з ДНК або перед перенесенням приготованих до проведення реакції ПЛР сумішей всі початкові реагенти повинні бути прибрані в морозильну камеру, призначену для робочих реактивів.
5.8.3. Не допускається повертати частково використані реактиви в холодильник для зберігання аліквот, так само як і в холодильник для зберігання початкових розчинів в промислових упаковках.
Зразки ДНК зберігають окремо від реагентів у відповідних холодильниках.
5.9. Після закінчення роботи всі об'єкти, що містять БПА, та реагенти прибирають у сховища (холодильники, шафи тощо), після чого робочі поверхні в обов'язковому порядку піддають дезінфекції.
5.10. Залишки БПА (або матеріалу) і посуд, використаний на етапах прийому, розбору і первинної обробки матеріалу, підготовки проб і виділення НК, приготування реакційних сумішей і проведення ПЛР, збирають в ємкості з дезрозчинами, що закриваються, і після відповідної експозиції передають в автоклавну.
Зливання рідин в каналізаційну мережу без знезараження не допускається.
5.11. Перенесення БПА (або матеріалу) і використаного посуду для знезараження здійснюють у щільно закритих промаркованих ємкостях.
5.12. У всіх приміщеннях ПЛР-лабораторії регулярно проводять вологе прибирання кожної робочої зони ПЛР-аналізу індивідуальним промаркованим інвентарем для прибирання, який заборонено використовувати для прибирання інших приміщень.
5.13. Працівників кожної робочої зони забезпечують відповідним спецодягом: медичним халатом, шапочкою, рукавичками і змінним взуттям, комплектами протичумного костюма тощо. При роботі в приміщенні детекції продуктів ампліфікації слід одягати бахіли.
Переміщення одягу із зони в зону категорично забороняється. Рекомендується використання одноразового одягу, особливо в "брудній" зоні ПЛР-лабораторії - кімнаті детекції продуктів ампліфікації.
5.13.1. Спецодяг працівників лабораторії позначають індивідуально та відповідно до розподілу по зонах (наприклад: одяг персоналу, що працює в різних зонах, може відрізнятися за кольором або фасоном). Зміна спецодягу проводиться не рідше одного разу на тиждень.
5.14. Вибір типу захисного костюма проводиться в суворій відповідності до ДСП 9.9.5.035.99 та ДСП 9.9.5.-080-2002 і визначається видом збудника, робочою зоною ПЛР-лабораторії, оснащенням її боксами біологічної безпеки.
5.14.1. Первинну обробку матеріалу, доставленого на дослідження (об'єднання або розділення проб, центрифугування, інактивацію тощо), виконують у захисному костюмі I - II або IV типу, доповненому рукавичками і в разі потреби респіратором.
5.14.2. У приміщенні підготовки проб і виділення НК при дослідженні матеріалу, інфікованого бактеріями I - II груп патогенності, інактивованого на етапі підготовки проб, роботу проводять у боксі біологічної безпеки II класу в костюмі IV типу, доповненому гумовими рукавичками.
5.14.3. На етапах проведення ПЛР, обліку результатів роботу проводять у таких видах захисного одягу:
- із знезараженим матеріалом - в костюмі IV типу, доповненому гумовими рукавичками;
- з пробами із зовнішнього середовища, інфікованими збудниками Кримської геморагічної гарячки, тяжкого гострого респіраторного синдрому, геморагічної гарячки з нирковим синдромом, Омської геморагічної гарячки - у костюмі I типу або в боксі біологічної безпеки II класу та в костюмі IV типу, доповненого гумовими рукавичками та респіратором;
- з матеріалом з іншими вірусами II групи патогенності роботи проводять у захисному костюмі IV типу, доповненому респіратором і гумовими рукавичками.
5.14.4. Надягання і зняття захисного одягу проводять у передбоксах. У кожному з них повинен бути окремий персональний комплект захисного одягу і взуття.
5.14.5. Захисний одяг зони детекції продуктів ампліфікації і в першу чергу гумові рукавички вважаються найбільш забрудненими продуктами ампліфікації. Перед зняттям одягу слід замінити рукавички, у яких працювали, на чисті.
Гумові рукавички міняють при проведенні обробки робочого місця (боксу безпеки та ПЛР-боксу до та після роботи), після внесення клінічних зразків при виділенні НК та перед елюцією.
6. Порядок обробки спецодягу при роботі в приміщеннях ПЛР-лабораторії
6.1. Використаний одяг підлягає замочуванню у дезінфекційному розчині (наприклад, у 0,2 % розчині засобу "Жавель-Клейд" протягом 60 хвилин або в інших засобах, зареєстрованих в Україні). Після цього прання проводять у воді з додаванням прального порошку при температурі 90 - 100° C.
6.2. При використанні одноразового робочого одягу його піддають дезінфекції, як зазначено в пункті 6.1 цих Правил, після чого автоклавують і утилізують, якщо роботи проводились з БПА I - II груп патогенності. Якщо роботи велись з матеріалом, підозрілим на вміст БПА III - IV груп патогенності, достатньо передати його на автоклавування, попередньо упакувавши для унеможливлення контамінації приміщень лабораторії при транспортуванні.
6.3. Прання та заміну робочого одягу із зони детекції продуктів ампліфікації проводять окремо від одягу з інших зон.
Забороняється одночасно проводити прання спецодягу з різних зон.
Здавати використаний і видавати чистий спецодяг слід дотримуючись поточності і розділивши ці операції у часі.
6.4. Захисні окуляри, змінне взуття протирають розчином дезінфекційного засобу і проводять ультрафіолетове опромінення вологих поверхонь протягом 1 години.
7. Вимоги до обробки приміщень і знезараження матеріалу в ПЛР-лабораторії
7.1. Всі дезінфекційні засоби, що застосовуються в ПЛР-лабораторії, повинні бути зареєстровані МОЗ України відповідно до Порядку державної реєстрації (перереєстрації) дезінфекційних засобів, затвердженого постановою Кабінету Міністрів України від 03.07.2006 N 908, та Порядку організації роботи з державної реєстрації (перереєстрації) дезінфекційних засобів та видачі реєстраційного свідоцтва, затвердженого наказом МОЗ України від 06.11.2006 N 739, зареєстрованого в Міністерстві юстиції України 17.11.2006 за N 1213/13087.
Дезінфекційні засоби повинні використовуватись за призначенням і відповідно до режиму використання.
7.2. Знезараження матеріалу, підозрюваного на інфікованість мікроорганізмами I - IV груп патогенності, проводять відповідно до ДСП 9.9.5.035.99, ДСП 9.9.5.-080-2002.
7.3. У кімнатах, у яких проводять роботу з виділеними НК, робочі поверхні, обладнання щодня опромінюють ультрафіолетовим промінням протягом 1 години до та після роботи. Підлогу щодня піддають вологому прибиранню із застосуванням дезінфікуючих засобів. Перед початком роботи робочу поверхню боксів додатково обробляють 70 % етиловим спиртом. Щомісяця з метою профілактики протирають робочі поверхні столів і штативи 1 N соляною кислотою.
7.4. На кожному робочому місці розташовують спеціальний контейнер з дезінфекційним розчином, у який скидають одноразовий пластиковий посуд (пробірки у відкритому стані, наконечники). Після відповідної експозиції розчин зливають у каналізаційну мережу, а відпрацьований пластик упаковують у термостійкий пакет для подальшого знезараження під тиском 0,2 МПа (2,0 кГс/см2) при температурі (132 2)° C протягом 60 хвилин Після автоклавування пакет може бути утилізований на полігоні побутових відходів.
7.5. Колби-пастки, штативи для пробірок та наконечників занурюють у дезінфекційні розчини. Усі предмети повинні перебувати в безпосередньому контакті з дезінфекційним засобом, навкруги предмета не повинно бути бульбашок повітря.
7.6. Відпрацьовані гелі та буфер з електрофоретичної камери поміщають у пластикову 5-літрову ємкість з кришкою, яка щільно загвинчується. Додають таку ж саму за об'ємом кількість розчину калію перманганату і розчину соляної кислоти. Акуратно перемішують і залишають при кімнатній температурі на 4 - 6 годин. Потім додають 1 об'єм розчину натрію гідроксиду, акуратно перемішують. Нейтралізовані реактиви зливають у каналізацію.
