В лабораторії пробірки з тампонами в ФБР добре струшують, тампони ретельно вижимають до стінок пробірки і викидають. Одержану суспензію клітин центрифугують протягом 5-7 хвилин при 2000 об/хв. Для одержання осаду клітин циліндричного епітелію ФБР зливають одним легким рухом, осад клітин ресуспендують пастерівською піпеткою в декількох краплинах розчину, що залишився на дні пробірки і використовують для приготування мазків. На добре знежирені і сухі предметні скельця, які до використання зберігаються в етиловому спирті (96 град.) або в суміші Никифорова, наносять пастерівською піпеткою по одній краплині на кожну флюоресціюючу сироватку. Мазки висушують при кімнатній температурі. Після цього мазки фіксують в хімічно чистому (чистому для аналізу) безводному ацетоні, заздалегідь охолодженому до 2-4 град.C. Фіксовані мазки до фарбування флуоресціюючими глобулінами можуть зберігатися в холодильнику при 4 град.C протягом тижня.
Для дослідження секційного матеріалу використовують шматочки трахеї, бронхів і легенів розміром , які перед приготуванням препарату промивають в стерильному фізіологічному розчині від крові. З слизової оболонки трахеї і бронхів препарат готують шляхом зіскоблювання скальпелем епітеліального покриву. Шматочки легенів після промивання підсушують фільтрувальним папером, роблять свіжий зріз і для отримання відбитку прикладають на ретельно знежирене предметне скло. Препарати підсушують і фіксують в охолодженому ацетоні 5 хв.
Культури клітин, чутливих до того чи іншого збудника вірусної інфекції, в пробірках з покривними скельцями заражають матеріалом від хворих (надосадною рідиною, що залишилася після приготування мазків для МІФ).
Заражені пробірки ставлять в термостат. Через 24-48 год. скельця виймають з пробірок загнутою пастерівською піпеткою і кладуть на предметне скло, прикріплюють лейкопластирем, висушують і фіксують, як вказано вище. Краще користуватися для вирощування культури клітин і приготування препаратів пеніциліновими флаконами.
Фарбування препаратів прямим способом.
Флуоресціюючі сироватки перед використанням повинні бути перевірені в препаратах культур клітин, інфікованих відповідними вірусами. Протигрипозні препарати доцільно перевіряти в первинно-трипсинованій культурі курячої ембріональної нирки. Аденовірусні, парагрипозні і РС-вірусні сироватки - на будь-якій стабільній лабораторній лінії клітин, яка підтримує репродукцію вказаних вірусів (Hela, Hep т.і.).
Фарбуючим титром кон'югату вважається те його кінцеве розведення, яке дає чітку флуоресценцію в дослідному препараті при відсутності її в контрольному.
Препарати від кожного хворого фарбують флуоресціюючим глобуліном A(HINI), A(H3№2), В, ПГ-1, 2, 3, РС-, аденовіруси, міколазма пневмонії, як вказано в інструкції до сироваток.
Фарбування препаратів за допомогою непрямого способу.
Використовують комерційні імунні противірусні сироватки з біологічними титрами не нижче 1:160 при робочому розведенні не нижче 1:2. Імунні сироватки можуть бути використані як в суміші, так і типові.
Для фарбування на препарати наносять 0,02 мл імунної сироватки в робочому розведенні, поміщають у вологу камеру при 37 град.C на 30 хв. Після фарбування препарати відмивають в проточній воді 40 хв., наносять флуоресціюючі специфічні антивидові глобуліни. Контакт здійснюється у вологій камері при 37 град.C протягом 15 хв. Відмивають фарбовані препарати так, як при прямому способі.
Оцінка результатів імунофлуоресценції.
При перегляді мазків звертають увагу на число і тип клітин, рівень їх світіння, наявність флуоресціюючих включень. В препаратах з носової порожнини людини найбільш часто зустрічаються клітини циліндричного та плиского епітелію, лейкоцити. Діагностичне значення має виявлення специфічного (яскраво-зеленого) світіння в 3-4 клітинах циліндричного епітелію, які мають келихоподібну або округлу форму з відповідно великим ядром і малою цитоплазматичною зоною. Локалізація світіння в клітинах частіше всього цитоплазматична, хоч при грипі і аденовірусній інфекції може бути ядерна. При наявності у хворого змішаної інфекції можна виявити одноразово два різних вірусних антигени з типовою локалізацією їх для тої чи іншої вірусної інфекції.
Лейкоцити і великі полігональні клітини з малим ядром (плиского епітелію) при аналізі препаратів до уваги не беруть.
При перегляді інфікованої і пофарбованої ФА культури клітин позитивний результат вважається при наявності достатнього яскраво-зеленого пофарбування структурних елементів клітин, які світяться в ядрі чи цитоплазмі <= і негативним (не дорівнює) при наявності слабкого дифузного світіння контурів клітин без чіткої диференціації клітинних структур порівняно з нефарбованою культурою клітин.
Контрольні дослідження.
При одночасному використанні різних флуоресціюючих глобулінів або імунних сироваток для дослідження мазків від хворих кожний з них є контролем для іншого. При роботі з культурою клітин необхідно мати як контроль незаражену культуру клітин (контрольні препарати) пофарбовані тими ж флуоресціюючими глобулінами.
Для перевірки специфічності флуоресценції проводять такі контрольні дослідження:
1. Обробка специфічним кон'югатом неінфікованих тканинних клітин;
2. Обробка неімунним і гетерологічним кон'югатом клітин, інфікованих вірусом;
3. Для зменшення специфічного світіння перед фарбуванням обробляють препарати неміченою імунною сироваткою.
Найбільш сучасним експрес-методом діагностики сьогодні вважається імуноферментний. Розроблені тест-системи для виявлення вірусів грипу А і В, РС-вірусу, мікоплазми пневмонії. В стадії розробки - тест-системи щодо аденовірусів, парагрипу, риновірусів. Постановка ведеться в полістиролових планшетах за загальноприйнятою методикою, облік реакцій проводиться за допомогою спектрофотометра (мультискана). Досліджується як матеріал безпосередньо від хворого, так і культуральна рідина інфікованих культур.
Методи серологічної діагностики грипу та інших ГРІ
Серологічна діагностика грунтується на виявленні приросту антитіл в парних сироватках хворих. Застосовують реакцію інгібіції гемаглютинації (РІГА), реакцію зв'язування комплементу (РЗК), реакцію пасивної гемаглютинації (РПГА), реакцію радіального гемолізу (РРГ). Враховуючи достатню інформативність цих методів, вони широко використовуються в епідеміологічному аналізі: визначення рівня колективного гуморального імунітету, ретроспективного аналізу природи епідемічних спалахів, оцінки імуногенної активності грипозних вакцин.
Для проведення серологічних реакцій як антигени використовують стандартні діагностикуми.
Реакція інгібіції гемаглютинації.
Використовується для діагностики грипу та парагрипозної інфекції. Метод грунтується на інгібіції гемаглютинаційної активності вірусу в присутності специфічних антитіл.
Для проведення РІГА з грипозними антигенами використовують 1% суспензію еритроцитів курей чи людини 0 (1) групи та діагностикуми із штамів, які резистентні до неспецифічних сироваткових інгібіторів. Реакція включає такі етапи роботи: підготовка сироваток, приготування робочої дози вірусу, суспензії еритроцитів, постановка реакції. Сироватки людини містять неспецифічні інгібітори, які спроможні затримувати гемаглютинацію і спотворювати результати РІГА. Перед постановкою реакції з грипозними діагностикумами парні сироватки від хворих розводять в 10 разів фізіологічним розчином (ФР) і прогрівають на водяній бані при 56 град.C протягом 30 хв.
При постановці РІГА з парагрипозними антигенами для вилучення неспецифічних інгібіторів сироватки обробляють еритроцитами морської свинки та коаліном. В цьому випадку сироватку змішують з 10% суспензією еритроцитів морської свинки у співвідношенні 1:5. Після 30-хвилинної інкубації при 4 град.C суміш центрифугують і до надосадової рідини додають рівний об'єм 25% розчину каоліну на ФР. Суміш активно струшують в шутелі 20 хв., а потім центрифугують 10 хв. при 2000 об/хв. Надосадова рідина - це сироватка в розведенні 1:10. В реакції використовують 0,5% суспензії еритроцитів морської свинки. В РІГА використовують розчин діагностикуму, що містить 4 аглютинуючі одиниці вірусу (АО) у робочій дозі. Постановку реакції ведуть, як вказано в інструкції до сироваток.
Діагностично достовірним є чотирикратне збільшення титрів антитіл у післяінфекційн й сироватці в порівнянні з сироваткою, отриманою на початку захворювання.
Реакція зв'язування комплементу (РЗК).
Ця реакція використовується у серодіагностиці грипу, РС-інфекції, аденовірусних захворюваннях. Вона не диференціює підтипи вірусів, але виявляє актитіла до загального комплементзв'язуючого антигену.
РЗК відноситься до складних серологічних реакцій. Окрім антигену і антитіл <= в ній беруть участь ще гемолітична система, яка виявляє результати реакції.
Найбільш прийнятим є мікрометод РЗК, завдяки якому досягається економія матеріалів і сироваток. Постановка РЗК детально викладена в інструкції до набору реагентів.
Реакція має найбільш широке застосування при діагностиці аденовірусної інфекції.
