Страница 5: Методичні вказівки з мікробіологічної діагностики кашлюку та паракашлюку (45093)

До 3 дм3 дистильованої води додають 0,75% хімічно чистої NaCl (з розрахунку на 3 дм3) і 4% агар-агар (з розрахунку на всю кількість середовища). Суміш поміщають в автоклав, де агар-агар розплавляється текучою парою протягом години. Після відстоювання (у виключеному автоклаві) агар фільтрують через один шар марлі, не виливаючи осаду. Сольовий агар (3 частини) і картопляний відвар (1 частина) змішують у гарячому вигляді, розливають у флакони й однократно стерилізують при 120°С протягом 30 хв. Реакцію середовища не перевіряють.

Перед уживанням до розтопленого й охолодженого до 45°С картопляно-гліцеринового агару додають стерильну дефібриновану кров у кількості 20-25% (цитратна і консервована кров непридатна).

7. Молочно-кров'яний агар

До 1дм3 водопровідної води додають 40- агару, хлориду натрію і розтоплюють в автоклаві. Потім фільтрують через кілька шарів марлі. До гарячого агару додають рівну кількість знежиреного молока, підігрітого до температури 65 - 70°С, перемішують і витримують в апараті Коха при текучій парі протягом 30-40хв., після чого фільтрують також в апараті Коха через кілька шарів марлі, дають відстоятися й обережно декантують верхній прозорий шар. Після цього середовище розливають у пляшки і стерилізують в автоклаві при 0,5 атм. протягом 40 хв. Перед уживанням до розплавленого й охолодженого до 44°С агару додають дефібриновану кров людини, коня, кролика або барана в кількості 20-25%.

8. Поживний агар з тирозином

До100см3 дистильованої води додають 3,5г сухого поживного агару і тирозину, розплавляють над полум’ям пальника, розливають у пробірки і стерилізують при 0,5 атм. 20-30 хвилин.

9.Середовище Сімонса

Для приготування середовища Сімонса беруть:

1) дистильована вода - 1дм3;

2)(NH4)2HP04 -1,5г;

3)КН2Р04 ;

4) Mg04 х 7Н20 - 0,2г;

5)Na-цитрат -3,0г;

6) Агар-агар - 20,0г.

У половині кількості дистильованої води розчиняють фосфорнокислий амоній, фосфорнокислий калій і сірчанокислий магній. В іншій частині води розплавляють агар. З’єднують обидві частини, попередньо зливши з осаду. Додають лимоннокислий натрій нейтральний, встановлюють рН 7,1-7,2. Додають індикатор - 1,6% розчин бромтимолового синього - 9,4см3. Стерилізують при 0,5 атм. 30 хвилин.

10. Бульйон Хоттінгера із сечовиною

До 100 см3 бульйону Хоттінгера рН 7,0 додають сечовини і 0,2см3 1,6% спиртового розчину крезолового червоного, стерилізують текучою парою при 100°С протягом 15 хв. Посів роблять у 1см3 середовища петлею, витримують 24 години при 35-37°С.

11.Реактиви для визначення уреази (метод Закса)

Готують 2 реактиви. Реактив А: 2г сечовини,

2 см3 96° етилового спирту,

4см3 дистильованої води.

Реактив В: 1 см3 0,2% спиртового розчину фенол-рота,

однозаміщеного фосфату калію (КН2РО4),

двозаміщеного фосфату калію (К2НР04),

100 см3 дистильованої води,

0,5г хлористого натру.

Реактив А не стерилізують і зберігають при температурі 4 - 10°С, реактив В стерилізують в автоклаві текучою парою. Перед уживанням змішують 1 частину реактиву А та 19 частин реактиву В.

12.Розчин для змочування тампонів

У конічній колбі змішують 90-95 см3 попередньо приготовленого 1/15 М розчину Na2HPO4 ( на 1дм3 дистильованої води) і 5-10см3 розчину КН2Р04 ( на 1дм3 дистильованої води); до цієї суміші додають агар-агару, стерилізують при 1 атм. 20 хв. Потім у гарячу суміш додають активованого вугілля (наважку вугілля стерилізують окремо). Суміш готують про запас і зберігають у холодильнику до 2-х місяців.

13. Приготування і стерилізація тампонів

13.1.Сухі ватні тампони: на один кінець металевого дроту, що легко згинається, щільно намотують шар гігроскопічної вати. Довжина намотки повинна бути - 4- (щоб уникнути аспірації вати). Кінець дроту з намотаною ватою (1-2см) згинають під тупим кутом 110-1200. Інший кінець дроту монтують у коркову або ватну пробку. Виготовлений тампон поміщають у пробірку і стерилізують в автоклаві при (112±1)°С протягом 30 хв. або в сушильній шафі при температурі 140-150°С протягом години.

13.2.Зволожені тампони: готують з дроту, що не іржавіє і легко згинається (краще алюмінієвого). Намотування вати, згинання і стерилізацію проводять так, як вказано для сухих тампонів. Стерильні тампони перед уживанням змочують у суміші (див. п.12) шляхом дворазового занурення в пробірку з рідиною. Після змочування тампона його поміщають у пробірку, а потім використовують для взяття матеріалу. Зберігати 3 дні в умовах холодильника.

14. Порядок використання антибіотиків

Для пригнічення сторонньої мікрофлори при посіві досліджуваного матеріалу використовують пеніцилін (або цефалексин). Їх застосовують як при обробці поверхні поживного середовища розлитого в чашки Петрі, так і шляхом внесення антибіотика в середовище. Для обробки поверхні середовища використовують антибіотик з розрахунку 7,5 МО, наносячи його на поверхню середовища шпателем, або вносячи його в розтоплений і охолоджений КВА з розрахунку 25-50 МО на 100см3 середовища. Пеніцилін розводять безпосередньо перед взяттям матеріалу. Для цього у флакон з антибіотиком додають стерильний фізіологічний розчин для одержання основного розведення пеніциліну. При вмісті у флаконі 500.000 МО, в нього додають 1см3 фізіологічного розчину, а при вмісті 1млн MО – 2 см3. Отримане основне розведення антибіотика у флаконі можна зберігати в умовах холодильника при +4°С не більше тижня. Для одержання необхідних для роботи концентрацій антибіотика 0,1см3 основного розведення з флакона розчиняють у 9,9 см3 стерильного фізіологічного розчину. 1см3 такого розчину містить 5 000 МО на 1см3. Далі роблять розведення до одержання 75 МО в 1см3 фізіологічного розчину.

Схема розведення пеніциліну:

1 пробірка - фізіологічний розчин 9,9 + 0,1см3 основного розведення антибіотика = у 1см3 5 000 МО;

2 пробірка - фізіологічний розчин 8,5+ 1,5розчину з першої пробірки антибіотика = у 1см3 750 МО;

3 пробірка - фізіологічний розчин 4,5+0,5розчину з другої пробірки антибіотика = у 1см3 75 МО.

З третьої пробірки наносять 0,1см3 (7,5 МО) на поверхню поживного середовища у кожній чашці, ретельно втираючи шпателем. Розчин із третьої пробірки можна використовувати для внесення його усередину середовища. Для цього 4см3 (300 МО) антибіотика додають на 1дм3 середовища (з розрахунку 30 МО на 100 см3 середовища). Це ж розведення можна використовувати для додавання до змочуючих рідин з розрахунку 0,1 см3 на 10-12 см3 рідини.

Робоче розведення антибіотика (в останній пробірці) використовують тільки в день приготування.

Додаток №4

Контроль якості поживних середовищ

1.Методика кількісного визначення азоту

Принцип методу оснований на блокуванні формальдегідом при рН 7,0 вільних аміногруп і титруванні лугом еквівалентної кількості карбоксильних груп. Початок і кінець титрування визначають потенціометрично.

Реактиви: їдкий натр 0,1N розчин;

соляна кислота 0,1N розчин;

формалін (40% розчин формальдегіду).

Перед кожним визначенням рН формаліну доводять до 7,0.

Хід визначення. Для аналізу використовують певний об’єм “B” рідкого зразка або розчину сухого зразка з вмістом амінного азоту 1,5-5 мг.

“В” дорівнює:

1) для рідких гідролізатів низького ступеня розщеплення (0,1-0,2% амінного азоту) – 3 см3;

2) середнього ступеня розщеплення (0,3-0,6% амінного азоту) – 1 см3;

3) високого ступеня розщеплення (0,7-1,3% амінного азоту) - 0,6 см3;

4) для рідких поживних середовищ (0,08-0,14% амінного азоту) – 3 см3;

5) для рідких екстрактів (0,02-0,04% амінного азоту) – 10 см3.

При аналізі сухих зразків, таких як сухі гідролізати, сухі поживні середовища, сухі екстракти з вмістом амінного азоту 1,5 - 4,0 %, “В” дорівнює 10 см3 1% розчину (наважка зразка “С”, що аналізується, складає 100 мг).

У склянку місткістю 50 см3 наливають об’єм “В” розчину зразка, що аналізується, і доводять загальний об’єм дистильованою водою до 20 см3. Електроди потенціометра занурюють у досліджуваний розчин, рН якого доводять до 7,0 за допомогою 0,1N розчину NaOH або 0,1N розчину соляної кислоти. Під час визначення електроди повинні залишатися зануреними в розчин. До нейтралізованого розчину додають 2 см3 нейтрального формаліну, перемішують і, не виймаючи електродів, титрують вміст 0,1N розчином їдкого натру до рН 9,1. При титруванні варто використовувати мікробюретку на 5см3.

Вміст амінного азоту в досліджуваному зразку в % (X) обчислюють за формулою:

1) для рідкого зразка:

X1 = (А * К * 1,4 * 100) / (В * 1000), де

А - кількість 0,1 N розчину NaOH у 1см3, використане на титрування досліджуваної проби;

К - поправка до титру 0,1 N розчину NaOH;

1,4 - кількість амінного азоту в мг, еквівалентне 1 см3 0,1 N розчину NaOH;

100 - коефіцієнт перерахунку у відсотки;

В - кількість рідкого зразка в см3, взяте на аналіз;

1000 - коефіцієнт перерахунку мг у г.;

2) для сухого зразка:

Х2=(А*К*1,4*100)/С, де

С - наважка сухого зразка, що аналізується, в мг, яка міститься в об’ємі “В”, що титрують;

інші позначення дивися вище.

2. Підготовка культур збудника кашлюку

для перевірки якості поживних середовищ

В. pertussis, висушена з замороженого стану під вакуумом, може зберігатися дуже довгий час в ампулі при температурі не вище 10°С. Ампулу з висушеним штамом розкривають стерильно над лотком. Верхній кінець ампули нагрівають на полум’ї пальника і знімають парафін, потім шматочком стерильної вати, змоченим у стерильній воді, обережно торкаються до відтягнутого кінця ампули так, щоб утворилась невелика тріщина, і також мокрою ватою обводять навколо носика ампули. Після утворення кругової (або не повністю кругової) тріщини, легким ударом пінцета видаляють кінець ампули.

Після розкриття ампули в неї асептично вносять 0,2-0,3 см3 стерильного фізіологічного розчину. Після розчинення сухого вмісту ампули його переносять пастерівською піпеткою на чашку з поживним середовищем і 48-72 години вирощують при температурі 35-37°С.

У перших пересівах мікроби мають дещо знижену життєздатність. Для відновлення повної життєздатності потрібно 2-3-пасажи на оптимальних поживних середовищах. Рекомендується для роботи користуватися культурою після другого або третього пересівання. Надалі культури В. pertussis зберігають на середовищі Борде-Жангу або КВА з 10% крові, пересіваючи 1 раз на 3-4 тижні. Дозволяється користуватися культурою не більше 10-го пасажу.

3.Контроль ростових якостей середовища із

сухого казеїново-вугільного агару (КВА)

У зв’язку з досить складним прописом казеїново-вугільного середовища і великою чутливістю його до режиму стерилізації, варто періодично перевіряти якість готового середовища. З цією метою необхідно використовувати щойно виділені культури В. pertussis.

У стерильних пробірках роблять 8 різних розведень суспензії 2-3-х добової культури. Густина суспензії в 1 пробірці повинна відповідати 5 млрд. мікробних тіл у 1см3 за стандартом мутності. В 2-6 пробірки наливають по 4,5 см3 стерильного фізіологічного розчину, у 7-у наливають 2 см3 і в 8-у - 1 см3. Поверхню однієї з двох чашок Петрі з досліджуваним середовищем ділять на 2-4 або 8 секторів (у залежності від поживного середовища): 0,5 см3 суспензії з 1 пробірки переносять стерильною піпеткою в 2 пробірку і цією ж піпеткою наносять 0,1 см3 суспензії на сектор 1. Іншою стерильною піпеткою перемішують вміст другої пробірки, переносять із неї 0,5 см3 у 3-ю пробірку і 0,1 см3 наносять на сектор 2 і т.д. Для кожного розведення слід вживати окрему стерильну піпетку, перемішуючи нею вміст пробірки. У 8-у пробірку переносять із 7-ї 1см3 суспензії, також перемішуючи стерильною піпеткою і наносять 0,1 см3 на сектор 8.

Чашку Петрі обережно, кришкою догори (щоб краплі не злилися) ставлять у термостат і витримують протягом 3-5 діб. Якщо середовище приготоване правильно, то на перших трьох секторах ріст має вигляд суцільних бляшок, на секторах 4, 5 і 6 виростають близько розташовані колонії, а на секторах 7 і 8 - невелика кількість ізольованих колоній. Якщо немає росту на останніх двох секторах, то середовищем користуватися не можна.

При використанні поживних середовищ з додаванням крові, чашки Петрі поділяють на два сектори, а при використанні сухих середовищ КВА з додаванням дріжджового екстракту - на 4 сектори.

У лабораторіях районних СЕС перевірку якості поживного середовища можна проводити за полегшеним методом. Посів колоній В. pertussis роблять на 1/16 поверхні чашки із середовищем КВА, розлитим у чашки Петрі. Усього перевіряють 5-10 колоній. Облік росту культури проводять через 48 годин. У випадку росту культури по всьому сектору - середовище доброї якості, при рості на 1/2 сектора - уповільнений ріст В. pertussis; ріст тільки на посівній площі - середовище непридатне.

Схема приготування розведень В. pertussis для перевірки якості КВА