В якості позитивного і негативного контролів необхідно вводити в дослід контроль відомих антигенів, а також контроль люмінесціюючої антивидової сироватки, в якому на одне поле досліджуваного мазка наносять тільки антивидовий люмінесціюючий гамаглобулін (сироватку).

Оцінку результатів мікроскопії проводять, як і в прямому методі, за 4-плюсовою шкалою.

МФА в непрямому варіанті для виявлення і ідентифікації рикетсій необхідно використовувати нарівні з прямим варіантом у випадках відсутності специфічних люмінесціюючих сироваток проти окремих видів рикетсій для прямого методу (наприклад, волинської гарячки) або при інших обставинах.

2.2. Реакція непрямої гемаглютинації з імуноглобуліновим рикетсійним еритроцитарним діагностикумом.

РНГА з імуноглобуліновим еритроцитарним діагностикумом призначена для виявлення і ідентифікації рикетсійних антигенів в матеріалах різного біологічного походження: заражених вошах, кліщах, внутрішніх органах інфікованих тварин, курячих ембріонах та в об'єктах оточуючого середовища. Рекомендується застосовувати метод при відсутності умов для діагностики збудників методом флуоресціюючих антитіл або паралельно з МФА.

Імуноглобуліновий рикетсійний еритроцитарний діагностикум (виробництва Пермського НВО "Біомед") являє собою ліофільно висушену 3%-у суспензію формалінізованих і тонізованих еритроцитів барана, сенсибілізованих імуноглобуліном проти рикетсій. В комплекті до діагностикуму додається сухий гамаглобулін до відповідних рикетсій для реакції гальмування непрямої гемаглютинації (РГНГА), яка використовується для контролю основного досліду. Для розведення інгредієнтів і постановки реакції використовують фізіологічний розчин з формаліном: до 100 мл фізіологічного розчину додають 0,3 мл формаліну.

Дослідження невідомого біологічного матеріалу необхідно проводити після попередньої інактивації його протягом 30 хвилин при температурі 56 град. С. Робота з неінактивованим матеріалом потребує дотримання протиепідемічного режиму роботи з матеріалом, зараженим або підозрілим на зараження збудниками інфекційних захворювань I та II груп патогенності.

Порядок постановки реакції. Готують для дослідження в РНГА суспензію на фізіологічному розчині. Кліщів однієї партії розтирають у фарфоровій ступці з розрахунку 1 мл фізіологічного розчину на 50 кліщів. Суспензію центрифугують протягом 10 хвилин при 1000 об/хв. Надосадову рідину досліджують в РНГА.

Воші, при необхідності, препарують і досліджують окремо кожну, готуючи з відпрепарованих кишечників суспензію в 1,5 мл фізіологічного розчину. При неможливості відпрепарувати кожну вошу, їх розтирають по 10-15 шт. в фарфоровій ступці в 1,5 мл фізіологічного розчину. Після центрифугування протягом 10 хвилин при 1000 об/хв надосадову рідину досліджують в РНГА. Внутрішні органи тварин або жовточні оболонки курячих ембріонів також розтирають в фарфоровій ступці для одержання 10%-ї суспензії у фізіологічному розчині, потім центрифугують протягом 10 хвилин при 1000 об/хв, надосадову рідину використовують для дослідження в РНГА.

Виготовлену, очищену та інактивовану суспензію біологічних субстратів розводять фізіологічним розчином з формаліном, починаючи з 1:2-1:4 до 1:32-1:64, в пробірках або лунках стандартних полістеролових панелей в об'ємі 0,4 мл. До розведень суспензії додають по 0,1 мл еритроцитарного імуноглобулінового діагностикуму. Сухий еритроцитарний діагностикум розводять фізіологічним розчином з формаліном в об'ємі, вказаному на етикетці ампули, і старанно струшують до одержання рівномірної суспензії еритроцитів. Панелі або пробірки з реагентами струшують і залишають при кімнатній температурі на 4-5 годин або до наступного дня, після чого враховують результат.

Реакція повинна супроводжуватись контролями:

1) Контроль досліджуваного матеріалу на відсутність неспецифічних результатів постановкою реакції гальмування непрямої гемаглютинації (РГНГА). Для цього готують послідовні розведення досліджуваного матеріалу, як і для РНГА. В кожну пробірку (лунку) додають по 0,05 мл 0,1% розчину специфічного імуноглобуліну (або гомологічну сироватку для РНГА в розведенні 1:40) і після експозиції 15 хвилин при кімнатній температурі додають по 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму.

2) Контроль еритроцитарного діагностикуму на відсутність спонтанної аглютинації еритроцитів: в 2 пробірки (лунки) з 0,4 мл формалінізованого фізіологічного розчину додають по 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму.

3) Контроль імуноглобуліну (використаної сироватки): до 0,4 мл фізіологічного розчину з формаліном додають 0,05 мл 0,1% розчину імуноглобуліну або сироватки в розведенні 1:40.

Облік результатів проводять по наявності або відсутності аглютинації еритроцитів.

При позитивному результаті ("+") аглютинат еритроцитів вистилає дно пробірки (лунки) в формі перевернутої парасольки, з тонким, нерівним краєм ("фестончастим").

При негативному результаті ("-") еритроцити осідають у вигляді диска або компактного кільця з чітким рівним краєм.

У випадках, коли на фоні рівномірно аглютинованих еритроцитів утворюється кільце з осаду неаглютинованих еритроцитів, результат оцінюється як сумнівний. Реакцію необхідно повторити.

Достовірний висновок РНГА про наявність специфічного антигена в досліджуваному матеріалі можна зробити, якщо:

- спостерігається чітка аглютинація діагностикуму з досліджуваним матеріалом в розведенні 1:2 і більше;

- в РГНГА спостерігається зниження титру специфічного антигена в досліджуваному матеріалі не менш ніж у 8 разів порівняно з РНГА;

- в контролях 2 та 3 спостерігаються негативні результати.

Для більш об'єктивного контролю реакції рекомендується також вводити в дослід контрольну постановку РНГА з відомим комерційним антигеном (для РАР або РЗК), специфічним до імуноглобулінового еритроцитарного діагностикуму. Для цього сухий антиген розводять фізіологічним розчином, з нього готують ряд розведень у фізіологічному розчині з формаліном - від 1:2 до 1:256 в об'ємі 0,4 мл і до кожного розведення додають по 0,1 мл еритроцитарного імуноглобулінового діагностикуму. Позитивні результати РНГА мають бути в розведенні специфічного антигена не менш 1:16.

РНГА з імуноглобуліновим еритроцитарним діагностикумом можна ставити також в мікроваріанті, використовуючи пластини з лунками для мікросерологічних реакцій. В такому випадку використовують 0,5%-у суспензію сенсибілізованих еритроцитів (відповідно до позначень на етикетці ампули); досліджувану суспензію розводять в об'ємі 0,05 мл і діагностикум добавляють по 0,025 мл; в РГНГА для контролю до досліджуваної суспензії додають 0,025 мл 0,1% розчину специфічного імуноглобуліну або специфічної сироватки (1:40), інші контролі також проводять у відповідному об'ємі.

2.3. Реакція нейтралізації антитіл

Для діагностики рикетсійних антигенів застосовують модифікацію РНГА - реакцію нейтралізації антитіл (РНАТ). Реакція, у постановці якої використовують антигенний еритроцитарний діагностикум для РНГА, основана на нейтралізації специфічних антитіл тест-сироватки антигеном рикетсій в досліджуваному матеріалі, внаслідок чого робоча доза тест-сироватки втрачає здатність викликати феномен специфічної аглютинації сенсибілізованих еритроцитів.

Для постановки РНАТ використовують антигенний еритроцитарний діагностикум для РНГА (свіжо сенсибілізованих або на основі формалінізованих еритроцитів) та специфічну тест-сироватку РНГА.

Перед постановкою основного досліду визначають робочу дозу тест-сироватки, що додається до еритроцитарного діагностикуму. Для цього сироватку титрують в РНГА, розводячи її з 1:50 до 1:1000 в об'ємі 0,2 мл. До розведень сироватки додають по 0,2 мл фізіологічного розчину і 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму. За результатами обліку РНГА визначають титр сироватки або одну гемаглютинуючу одиницю (ГАО). В досліді використовують дві гемаглютинуючі одиниці, тобто розведення сироватки, в 2 рази менше її титру.

Реакцію ставлять в пробірках або лунках стандартних полістеролових панелей. Досліджувану суспензію, попередньо інактивовану, розводять фізіологічним розчином, починаючи з 1:2 і далі - до 1:64, в об'ємі 0,2 мл. До розведеної суспензії додають по 0,2 мл тест-сироватки в подвійному титрі (2 аглютинуючі одиниці) і залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі (20-22 град. С). Через 30 хвилин в усі пробірки додають по 0,1 мл антигенного еритроцитарного діагностикуму. Після утримання в термостаті (37 град. С) протягом 2-3 годин або при кімнатній температурі (20-22 град. С) 16-20 годин враховують результати реакції.

Основний дослід РНАТ супроводжується контролями:

1) контроль еритроцитарного діагностикуму: до 0,4 мл фізіологічного розчину додають 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму;

2) контроль досліджуваного антигена: до 0,2 мл суспензії додають 0,2 мл фізіологічного розчину та 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму;

3) контроль робочої дози тест-сироватки: у дві пробірки (лунки) до 0,2 мл фізіологічного розчину додають 0,2 мл тест-сироватки - з однією та двома робочими дозами антитіл (аглютинуючими одиницями) та 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму.

Результат реакції оцінюють по наявності або відсутності феномена гемаглютинації, так само, як і при постановці РНГА з відповідним еритроцитарним діагностикумом. Однак інтерпретація результатів РНАТ протилежна інтерпретації РНГА. Позитивною РНАТ вважається у випадку відсутності аглютинації сенсибілізованих еритроцитів і негативною - при наявності чіткої аглютинації сенсибілізованих еритроцитів.

Титром антигена в досліджуваній суспензії вважають максимальне його розведення, яке обумовлює нейтралізацію антитіл двох гемаглютинуючих одиниць тест-сироватки.

Достовірною РНАТ вважається при умові відсутності гемаглютинації в контролі еритроцитарного діагностикуму і досліджуваного антигена та позитивних результатах РНГА в контролі тест-сироватки.

3. Порядок застосування серологічних методів

3.1. Діагностика рикетсіозів групи висипного тифу. Для лабораторної діагностики рикетсіозів групи висипного тифу: епідемічного (вошивого) висипного тифу і його рецидивної форми - хвороби Бриля та ендемічного (щурячого) висипного тифу необхідно застосовувати лабораторні тести: реакцію зв'язування комплементу (РЗК); реакцію непрямої гемаглютинації (РНГА); реакцію аглютинації рикетсій (РАР); непрямий метод флуоресціюючих антитіл (нМФА).

Реакцію зв'язування комплементу вважають основним методом лабораторної діагностики рикетсіозів групи висипного тифу, оскільки вона ефективна для поточної і ретроспективної діагностики та внутрішньогрупової диференціації збудників. Комплементзв'язуючі антитіла в крові зберігаються десятиріччями після перенесення висипнотифозної інфекції, тому РЗК, як і нМФА, використовують в епідеміологічних дослідженнях для пошуку джерел інфекції і вивчення імунологічної структури населення. Для виявлення активних форм інфекції діагностичний титр РЗК становить 1:160, при ретроспективній діагностиці реакцію враховують з розведення сироватки 1:10.

Реакція непрямої гемаглютинації у хворих на висипний тиф (хворобу Бриля) визначається, як правило, у високих титрах: 1:1000-1:25600 і вище. Реакція специфічна при розведенні сироватки 1:100, діагностичний титр її дорівнює 1:1000. На відміну від РЗК, РНГА буває позитивною тільки протягом активної фази висипнотифозної інфекції і в найближчі строки реконвалесценції (до 6 місяців). Це дозволяє використовувати РНГА для диференціації свіжих антитіл від анамнестичних, що визначаються в РЗК.

Реакція аглютинації рикетсій є найпростішим методом діагностики висипного тифу (хвороби Бриля). РАР буває позитивною при свіжих формах інфекції. Після перенесеного захворювання зберігається протягом року, інколи більше, тільки в невисоких титрах (1:10-1:20). Діагностичний титр РАР дорівнює 1:40 - при використанні діагностикуму рикетсій, культивованих за методом Вейгля, Львівського ДП "Львівдіалік", або 1:160 - при використанні антигена рикетсій, культивованих в курячих ембріонах, Пермського НВО "Біомед".

Непрямий метод флуоресціюючих антитіл при висипнотифозній інфекції є більш чутливим в порівнянні з РЗК: вже на першому тижні визначається в титрах 1:320-1:2560, на 10-15-й дні - 1:2560-1:10240. Багаторічний досвід застосування нМФА при висипному тифі дає підставу рекомендувати цей універсальний і перспективний метод усім лабораторіям, в яких є умови для постановки реакції - для верифікації гострих форм інфекції, ретроспективної діагностики і диференціації класів специфічних імуноглобулінів.

За даними Українського центру з рикетсіозів, специфічні антитіла проти рикетсій Провачека у хворих на висипний тиф (хворобу Бриля) починають виявлятись вже в кінці першого (5-7-й дні) і на початку другого тижня захворювання. В невисоких титрах антитіла визначались: в РЗК (1:10-1:80) - в 32,1% випадків, РНГА (1:100-1:400) - в 30,1%, РАР (1:5-1:20) - в 28,9% випадків. В середніх титрах антитіла виявлялись: в РЗК (1:160-1:640) - в 46,1% випадків; РНГА (1:800-1:3200) - 46,1%; РАР (1:40-1:80) - 42,7% випадків. Частина сироваток вже в цей період захворювання реагувала у високих титрах: по РЗК - 1:1280 - 5120, РНГА - 1:6400-1:26500, РАР - 1:160-1:320. В кінці 2-го і на початку 3-го тижня захворювання спостерігалось зростання титрів антитіл у всіх серологічних реакціях. Комплементзв'язуючі антитіла визначались майже у всіх хворих в титрах 1:640-1:1280, гемаглютиніни - 1:1600-1:25600, аглютиніни - 1:160-1:320.

Таким чином, у хворих на висипний тиф (хворобу Бриля) специфічні антитіла у всіх серологічних тестах виявляються майже в однакові терміни від початку захворювання (наприкінці першого тижня), але найбільш високими бувають в РНГА. Характерно більш раннє (на 1-2-й дні) виявлення антитіл у хворих на рецидивну форму висипного тифу (хворобу Бриля) в порівнянні з хворими на епідемічний висипний тиф. В динаміці хвороби титри антитіл підвищуються, досягаючи максимуму в кінці другого тижня (14-15-й дні). Для РНГА характерно швидке підвищення титрів в період розпалу хвороби і відносно швидкий спад їх в період реконвалесценції. Інші серологічні реакції характеризуються відносно помірним підвищенням і помірним зниженням в період реконвалесценції, при цьому РЗК та нМФА в низьких титрах (1:10-1:40-1:80) зберігаються багато років і навіть десятиліть.