|розчин | | | | | | | | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Інкубація протягом 1 години при 37 град. С |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Другий етап |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Гемолітична |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 | 0,4 |0,4 |0,4 | 0,4 |
|система | | | | | | | | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Інкубація протягом 30 хвилин при 37 град. С |
---------------------------------------------------------------------------
Облік результатів після витримування протягом 1 години при кімнатній температурі.
Таблиця 5
Схема постановки основного досліду РЗК в об'ємі 0,5 мл
---------------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти, | Розведення сироватки | Контролі |
| мл |-------------------------------+---------------------------|
| |1:10|1:20|1:40|1:80|1:160|1:320|сиро-|Анти-|компле |гемолі-|
| | | | | | | |автки|гена |менту |тичної |
| | | | | | | | | | |системи|
|-------------------------------------------------------------------------|
| Перший етап |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Сироватка |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 | 0,1 | | | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Антиген |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 | |0,1 | | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Комплемент |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 | 0,1 |0,1 |0,1 | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Фізіологічний| | | | | | | 0,1 |0,1 |0,2 | 0,3 |
|розчин | | | | | | | | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Інкубація протягом 1 години при 37 град. С |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Другий етап |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Гемолітична |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 |0,2 | 0,2 |
|система | | | | | | | | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Інкубація протягом 30 хвилин при 37 град. С |
---------------------------------------------------------------------------
Облік результатів після витримування протягом 1 години при кімнатній температурі.
1.2. Реакція непрямої гемаглютинації
Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) є найбільш чутливим методом для виявлення протирикетсійних специфічних антитіл у сироватці крові. Суть методу полягає в тому, що еритроцити з адсорбованим на їх поверхні рикетсійним полісахаридним гаптеном аглютинуються специфічною сироваткою. На відміну від РЗК, реакція непрямої гемаглютинації буває позитивною тільки на протязі активної фази інфекції і в найближчі терміни реконвалесценції (до 6 місяців), завдяки чому РНГА дозволяє диференціювати свіжі або відносно недавні форми захворювання. При клінічній діагностиці і епідеміологічних дослідженнях рекомендується застосовувати паралельно РЗК і РНГА для диференціації свіжих антитіл від анамнестичних.
В РНГА використовують такі інгредієнти: досліджувану сироватку; стерильний фізіологічний розчин; рикетсійний антиген; еритроцити барана (або людини 0 (I) групи, (R -).
Для постановки РНГА застосовують антиген рикетсій, яким сенсибілізують свіжі еритроцити барана (або людини) безпосередньо перед дослідом або ж антигенний еритроцитарний діагностикум, котрий являє собою суспензію формалінізованих еритроцитів барана, сенсибілізованих рикетсійним антигеном.
Реакцію ставлять в об'ємі 0,5 мл в старанно вимитих і висушених стандартних полістеролових панелях з лунками або в пробірках, можна також ставити РНГА в мікроваріанті в планшетах з лунками типа "U" мікротитратора Такачі.
Порядок постановки РНГА. Сироватки перед дослідженням в РНГА розводять фізіологічним розчином 1:10 і інактивують при 56 град. С протягом 30 хвилин. Для адсорбції гетерогенних гемаглютинінів до інактивованої сироватки додають 0,05 мл осаду відмитих еритроцитів барана (або людини) на 1 мл розведеної 1:10 сироватки. Суміш старанно перемішують і залишають на 20 хвилин при кімнатній температурі, періодично струшуючи її. Потім сироватку центрифугують 10 хвилин при 2500-3000 об/хв. Надосадову рідину відсмоктують, переносять в чисту пробірку і використовують для постановки реакції, готуючи ряд розведень у фізіологічному розчині від 1:100 до 1:12800 і далі в об'ємі 0,4 мл.
Приготування еритроцитарного діагностикуму. Сухий антиген перед використанням в реакції розводять фізіологічним розчином в об'ємі, що вказаний на етикетці. До 4 мл розведеного або нативного рідкого антигена для РНГА додають 0,1 мл осаду відмитих еритроцитів барана (або людини). Після старанного перемішування суміш в пробірці поміщають на 1 годину в термостат (37 град. С), періодично, через 10-15 хвилин, перемішуючи для кращої адсорбції антигена на поверхні еритроцитів. Через годину суміш центрифугують протягом 10 хвилин при 2500 об/хв і повністю видаляють надосадову рідину. Осад ресуспендують в 10 мл фізіологічного розчину, старанно перемішуючи струшуванням. Таким чином, одержують 1%-у суспензію еритроцитів, сенсибілізованих рикетсійним антигеном. Такий діагностикум можна зберігати декілька днів при температурі 4 град. С без зниження його активності.
При використанні антигена для РНГА ДП "Львівдіалік" свіжі сенсибілізовані еритроцити можна зберігати у рефрижераторі (4 град. С) без відмивання в антигені до 20 днів, використовуючи еритроцити порціями для постановки реакції. Безпосередньо перед дослідом беруть частину суспензії еритроцитів з антигеном, еритроцити відділяють від антигена центрифугуванням і ресуспендують в фізіологічному розчині з розрахунком одержання 1%-ї суспензії.
Техніка постановки РНГА полягає в тому, що до приготовлених розведень досліджуваної сироватки в об'ємі 0,4 мл додають по 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму, тобто 1%-ї суспензії еритроцитів, сенсибілізованих рикетсійним антигеном. Після перемішування струшуванням, пробірки або панель із сумішшю поміщають на 2-3 години в термостат (37 град. С) або на 16-20 годин при кімнатній температурі (20 град. С).
Дослід повинен супроводжуватись такими контролями (табл. 6):
1) контроль досліджуваної сироватки: до 0,4 мл сироватки в початковому розведенні (1:100) додають 0,1 мл 1%-ї суспензії несенсибілізованих еритроцитів барана (людини);
2) контроль еритроцитарного діагностикуму: до 0,4 мл фізіологічного розчину додають 0,1 мл діагностикуму;
3) контроль нативних еритроцитів, використаних для виготовлення діагностикуму: до 0,4 мл фізіологічного розчину додають 0,1 мл 1%-ї суспензії еритроцитів барана (людини).
Паралельно з досліджуваними сироватками доцільно ставити РНГА з завідомо позитивною сироваткою відомого титру.
Облік результатів реакції проводять неозброєним оком по наявності або відсутності аглютинації еритроцитів. Реакцію вважають позитивною (оцінюють на "+"), якщо аглютиновані еритроцити збираються на дні лунки або пробірки у вигляді перевернутої парасольки з рівними або нерівними "фестончастими" краями. При струшуванні еритроцити відділяються від дна у вигляді конгломератів аглютинованих еритроцитів.
Реакцію вважають негативною (оцінюють на "-"), якщо еритроцити осідають на дно лунки або пробірки у вигляді диска (ґудзика) з чітким рівним краєм. При струшуванні еритроцити утворюють рівномірну гомогенну суспензію. В сумнівних випадках реакцію слід повторити. Достовірною реакція вважається при наявності негативних результатів в контролях - сироватки, діагностикуму і еритроцитів.
Титром досліджуваної сироватки вважають максимальне її розведення, яке викликає чітку аглютинацію сенсибілізованих еритроцитів. Позитивною РНГА слід вважати з розведення 1:100, діагностичним титром - 1:1000.
Пермське НВО "Біомед" виготовляє готовий для застосування антигенний еритроцитарний діагностикум для РНГА - суспензію 3%-х формалінізованих еритроцитів барана, сенсибілізованих рикетсійним полісахаридом. Еритроцитарний діагностикум комплектується 6%-ю суспензією несенсибілізованих (контрольних) формалінізованих еритроцитів барана для контролю досліджуваних сироваток і адсорбції із сироваток неспецифічних гемаглютинінів. Для розведення інгредієнтів реакції використовують формалінізований фізіологічний розчин (ФФР): 0,9%-й розчин хлориду натрію, до якого додають формалін з розрахунку 0,3 мл на 100 мл розчину.
Таблиця 6
Схема постановки РНГА
------------------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти, | Розведення сироватки | Контроль |
|мл | | |
| |--------------------------------------+-----------------------|
| |1:100|1:200|1:400|1:800|1:1600|1:3200 |сиро- |діагнос-|еритро-|
| | | | | | | |ватки |тикуму |цитів |
|-------------+-----+-----+-----+-----+------+-------+------+--------+-------|
|Сироватка |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 | 0,4 | 0,4 | | |
|-------------+-----+-----+-----+-----+------+-------+------+--------+-------|
|Діагностикум |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 | 0,1 | | 0,1 | |
|(1%-а | | | | | | | | | |
|суспензія | | | | | | | | | |
|сенсибілізо- | | | | | | | | | |
|ваних | | | | | | | | | |
|еритроцитів) | | | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+-----+-----+------+-------+------+--------+-------|
|Фізіологічний| | | | | | | | 0,4 | 0,4 |
|розчин | | | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+-----+-----+------+-------+------+--------+-------|
|Свіжі | | | | | | | 0,1 | | 0,1 |
|еритроцити | | | | | | | | | |
|(1%-а | | | | | | | | | |
|суспензія) | | | | | | | | | |
------------------------------------------------------------------------------
РНГА з готовим для застосування діагностикумом можна ставити в макроваріанті в об'ємі 0,5 мл і в мікроваріанті - в планшетах з лунками типа "U" мікротитратора Такачі. При постановці реакції в макроваріанті еритроцитарний діагностикум і контрольні еритроцити використовують у вигляді 1,5%-ї суспензії, тобто діагностикум розводять в 2 мл ФФР, а контрольні еритроцити - в 4 мл. При постановці реакції мікрометодом еритроцитарний діагностикум і контрольні еритроцити використовують у вигляді 0,5%-ої суспензії: інгредієнти розводять, відповідно, в 6 та 12 мл ФФР.
Для постановки РНГА досліджувану сироватку, попередньо інактивовану і виснажену формалінізованими контрольними еритроцитами, розводять в об'ємі 0,4 мл (у мікроваріанті - 0,05 мл) - 1:100 і далі, додають в кожне розведення по 0,1 мл діагностикуму (у мікроваріанті - 0,025 мл) і суспензію старанно перемішують. Облік результатів реакції проводять після зберігання при кімнатній температурі - відповідно 4-5 та 2-3 години. Реакція має супроводжуватись контролями: сироватки, еритроцитарного діагностикуму і обов'язково контролем позитивної тест-сироватки, що додається в комплекті діагностикуму.
Модифікацією РНГА, що забезпечує одержання результатів протягом 1 години, є реакція непрямого гемолізу (РНГ). Суть цієї реакції полягає в тому, що в систему РНГА (досліджувана сироватка + сенсибілізовані полісахаридним гаптеном свіжі еритроцити барана) додають комплемент, розведений 1:10 в об'ємі 0,1 мл. При позитивному результаті замість аглютинації еритроцитів спостерігається феномен гемолізу. Титри РНГ з позитивними сироватками співпадають з титрами РНГА. Результати апробації реакції непрямого гемолізу в Українському центрі з рикетсіозів МОЗ України дають підставу рекомендувати цей тест для практичного застосування при необхідності швидко одержати результат.
1.3. Реакція аглютинації рикетсій
Реакція аглютинації рикетсій (РАР) є найбільш простим і доступним методом лабораторної діагностики рикетсійних захворювань. Перевагою цього методу діагностики є мінімальне число компонентів реакції (досліджувана сироватка + антигенний діагностикум), що дозволяє застосовувати його в кожній лабораторії для первинної (скринінгової) діагностики. Однак РАР менш чутлива в порівнянні з РЗК і особливо РНГА, потребує високого ступеня очищення антигенних діагностикумів, не позбавлена певного суб'єктивізму в оцінці результатів при використанні безколірного антигена. Тому усі сироватки, котрі позитивно реагують в РАР, незалежно від титру реакції, а також з сумнівними результатами обов'язково повинні бути дослідженні в РЗК і РНГА.
Для постановки РАР необхідні такі інгредієнти: досліджувана сироватка, яка має бути неінактивованою, прозорою, без ознак гемолізу та свіжою (не більше 10 днів зберігання); корпускулярний антиген - безколірний з рикетсій, культивованих в курячих ембріонах, або антиген коричневого кольору з рикетсій Провачека, культивованих за методом Вейгля; стерильний фізіологічний розчин. Дозволяється застосовувати дві модифікації постановки РАР в макроваріанті: об'ємний - в об'ємі 0,4 мл і крапельний, запропонований Г.С.Мосінгом, в загальному об'ємі 6 крапель. В крапельному варіанті постановки РАР використовують антиген рикетсій, культивованих за методом Вейгля, з природним забарвленням коричневого кольору, що дозволяє більш об'єктивно оцінювати результати реакції, ніж при застосуванні незабарвленого антигена з яєчних культур рикетсій з курячих ембріонів.
При об'ємному способі постановки РАР досліджувану сироватку розводять фізіологічним розчином в ряді пробірок в об'ємі 0,2 мл, починаючи з 1:5. До різних розведень сироватки додають по 0,2 мл антигена, таким чином розводячи сироватку ще в два рази. Дослід супроводжують контролями: сироватки - 0,2 мл сироватки в розведенні 1:5 + 0,2 мл фізіологічного розчину; антигена - 0,2 мл фізіологічного розчину + 0,2 мл антигена. Штатив з пробірками поміщають в термостат (37 град. С) на 18-20 годин. Облік результатів проводять через 2-3 години зберігання при кімнатній температурі.
