---

ГОСТ 28566-90

(СТ СЭВ 6646-89)

Группа Н09

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод выявления и определения количества энтерококков

Food products. Method for detection and determination of count Enterococci

ОКСТУ 9109

Срок действия с 01.07.91

до 01.07.96*

_______________________________

* Ограничение срока действия снято

по протоколу N 5-94 Межгосударственного Совета

по стандартизации, метрологии и сертификации

(ИУС N 11-12, 1994 год).

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности

РАЗРАБОТЧИКИ

В.И.Рогачев, д-р техн. наук; Б.И.Голод, канд. биол. наук; Р.А.Волкова

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 29.05.90 N 1332

3. Срок первой проверки - 1996 г.

Периодичность проверки - 5 лет

4. Стандарт соответствует стандарту СЭВ 6646-89

5. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

6. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления и количественного определения энтерококков (Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus avium, Streptococcus gallinarum).

Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведении в жидкую селективную среду или на поверхность плотной селективной среды, аэробном культивировании посевов при (37±1) °С в течение 24-48 ч, подтверждении принадлежности выросших микроорганизмов к энтерококкам, пересчете их количества на 1,0 г (см ) продукта.

1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

Отбор проб - по ГОСТ 26668, подготовка к испытанию - по ГОСТ 26669.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104*, с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности ±2 мг (для взвешивания реактивов);

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 24104-2001, здесь и далее по тексту.

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности ±10 мг (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический с увеличением в 900-1000 раз;

стерилизатор горячим воздухом;

термостат с диапазоном рабочих температур от 28 до 55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ±1 °С;

холодильник бытовой;

водорода перекись по ГОСТ 10929;

желчь крупного рогатого скота или сухая желчь;

железо (III) - аммония гидроцитрат;

ферментативный гидролизат казеина;

канамицин сульфат во флаконах по 0,5 г - 500000 ЕД и 1 г - 1000000 ЕД, в ампулах по 5 и 10 см 5% раствора, содержащих 0,25 и 0,5 г препарата;

полимиксин М сульфат во флаконах по 500000 ЕД;

эскулин;

натрия гидрокарбонат (NаНСО ) по ГОСТ 4201.

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1. Приготовление растворов

3.1.1. Раствор с объемной долей перекиси водорода 10%:

33,3 см перекиси водорода с содержанием основного вещества 30% (в случае если перекись водорода имеет другое содержание основного вещества, то делается пересчет) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см , доводят объем дистиллированной водой до метки.

3.1.2. Раствор с массовой долей НСl 5%: 11,5 см концентрированной соляной кислоты переносят в мерную колбу вместимостью 100 см , доводят объем дистиллированной водой до метки.

3.1.3. Раствор массовой концентрацией натрия гидроокиси 50 г/дм : 5 г натрия гидроокиси переносят в мерную колбу вместимостью 100 см , растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.4. Раствор 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) массовой концентрацией 10 г/дм : 1 г ТТХ переносят, смывая дистиллированной водой в мерную колбу вместимостью 100 см , доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670. В темной плотно закрытой посуде раствор хранят при (4±2) °С не более 3 мес.

3.1.5. Раствор массовой концентрацией теллурита калия 20 г/дм : 2 г теллурита калия переносят, смывая дистиллированной водой в мерную колбу вместимостью 100 см , доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670.

3.1.6. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромтимолового синего 16 г/дм : 1,6 г бромтимолового синего переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.1.7. Раствор массовой концентрацией кристаллического фиолетового 0,1 г/дм : 0,01 г кристаллического фиолетового переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.8. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромкрезолового пурпурного 16 г/дм : 1,6 г бромкрезолового пурпурного переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.1.9. Раствор массовой концентрацией натрия азида 100 г/дм : 10 г натрия азида переносят в мерную колбу вместимостью 100 см , растворяют при легком подогревании в дистиллированной воде и раствор доливают до метки. Раствор готовят под вытяжкой, так как пары натрия азида ядовиты.

3.1.10. Раствор массовой концентрацией канамицина сульфата 50 г/дм (50000000 ЕД) и 100 г/дм (100000000 ЕД): во флаконы с 0,5 г или 1 г препарата вносят 10 см стерильной дистиллированной воды, содержимое флаконов растворяют.

3.1.11. Молоко обезжиренное готовят по ГОСТ 10444.1.

3.1.12. Растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1. Азидно-глюкозный бульон

Основа среды: к 1 дм мясопептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, добавляют 5,0 г пептона, 7,5 г глюкозы, 2,5 г натрия хлорида, составные части растворяют нагреванием. После этого охлаждают и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации при 25 °С он составлял (7,2±0,1). Затем основу среды стерилизуют текучим паром (при 100 °С) в течение 30 мин. К основе среды, охлажденной до 50 °С, добавляют 2,0 см натрия азида, приготовленного по п.3.1.9, и 2,0 см раствора бромкрезолового пурпурного, приготовленного по п.3.1.8. Готовую среду не стерилизуют. Среду хранят в защищенном от света и высыхания виде при (4 ±2) °С не более 3 мес. Непосредственно перед использованием ее разливают по 5 см в стерильные пробирки.

3.2.2. Глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с рН 7,2 и 9,6: 5,0 г триптона или ферментативного казеинового гидролизата, 12,5 см дрожжевого экстракта, 1,0 г глюкозы добавляют к 1 дм дистиллированной воды. Смесь, периодически помешивая, подогревают до полного растворения всех составных частей, охлаждают и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,2±0,1) или (9,6±0,1).

Среду разливают по 5 см в пробирки и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 15 мин. Среду хранят при (4±2) °С не более 14 сут.

3.2.3. Солевой бульон

Основа среды - глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с рН (7,2±0,1) по п.3.2.2.

При приготовлении питательной среды в 1 дм основы среды растворяют на водяной бане 65,0 г натрия хлорида, разливают по 5 см в пробирки, стерилизуют при (121±1) °С в течение 15 мин.

Питательную среду можно готовить за одну операцию, тогда в процессе приготовления основы среды добавляют 65,0 г натрия хлорида. Среду хранят при (4±2) °С не более месяца.

3.2.4. 40%-ный желчный бульон

Основа среды - глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с рН (7,2±0,1). К 600 см охлажденной до 45-55 °С основы среды добавляют асептически 400 см стерильной профильтрованной желчи крупного рогатого скота или эквивалентное количество сухой желчи.

Среду хранят при (4±2) °С не более 3 мес.

3.2.5. Селективный агар по Сланецу и Бертли:

20,0 г пептона, 25,0 см дрожжевого экстракта, 2,0 г глюкозы, 4,0 г калия фосфорнокислого двузамещенного, (15,0±3,0) г агара помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см , доливают дистиллированной водой до метки, нагревают до растворения компонентов. Охлаждают, устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,2±0,1). Стерилизуют текучим паром (при 100 °С) в течение 30 мин, охлаждают до 50 °С. Добавляют 4,0 см раствора азида натрия, приготовленного по п.3.1.9, и 10,0 см раствора 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлорида, приготовленного по п.3.1.4, хорошо перемешивают и разливают по чашкам Петри. Среду хранят при (4±2) °С не более 7 сут.

3.2.6. Канамицин азидно-эскулиновый агар (КАЭ-агар):

20,0 г пептона из казеина, 25,0 см дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлорида, 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,5 г железа (III) - аммония гидроцитрата, 1,0 г эскулина, (15,0±3,0) г агара помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см , доливают дистиллированной водой до метки. Растворяют составные части при нагревании, охлаждают, устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации при 25 °С он составлял (7,1±0,1). Стерилизуют при (121±1) °С в течение 15 мин, охлаждают до 50 °С, добавляют 1,5 см раствора азида натрия, приготовленного по п.3.1.9, и 0,4 см раствора канамицина сульфата массовой концентрацией 50 г/дм или 0,2 см раствора канамицин сульфата массовой концентрацией 100 г/дм и разливают по чашкам Петри. Среду хранят при (4±2) °С не более 7 сут.

3.2.7. Глюкозо-триптонный агар с дрожжевым экстрактом с рН (7,2±0,1) готовят по п.3.2.2, но при приготовлении добавляют на 1 дм среды (15,0±3,0) г агара.

3.2.8. Щелочная полимиксиновая среда:

Основа среды - к 400 см мясо-пептонного бульона по ГОСТ 10444.1 добавляют 5 г натрия хлорида, 10 г глюкозы, 10 см дрожжевого экстракта. Основу среды стерилизуют при (110±1) °С в течение 12 мин, охлаждают и добавляют 250 см раствора натрия карбоната массовой концентрацией 21,2 г/дм и 250 см раствора бикарбоната натрия массовой концентрацией 10 г/дм . Устанавливают рН таким образом, чтобы при 25 °С он составлял (10,1±0,1). После этого к среде добавляют 200000 ЕД полимиксина М сульфата, 5,0 см спиртового раствора бромтимолового синего, приготовленного по п.3.1.6. Среду хранят в защищенном от света и высыхания виде при (4±2) °С не более 7 сут. Непосредственно перед использованием среду разливают по 5 см в стерильные пробирки.

3.2.9. Молочно-ингибиторная среда (МИС):

К 850 см расплавленного и охлажденного до 50 °С мясо-пептонного агара, приготовленного по ГОСТ 10444.1, добавляют 150 см обезжиренного молока, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 12,5 см раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п.3.1.7, 10,0 см раствора калия теллурита, массовой концентрацией 20 г/дм , 200 000 ЕД полимиксина М сульфата. Среду не стерилизуют, разливают в стерильные чашки Петри и хранят при (4±2) °С не более 10 сут. Допускается взамен раствора калия теллурита добавлять в среду 5,0 см раствора 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлорида, приготовленного по п.3.1.4.

4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить ожидаемое количество энтерококков в 1,0 г (см ) продукта или определить допустимое количество энтерококков, указанное в нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта.

При выявлении энтерококков из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений так, чтобы можно было определить минимальное количество продукта, содержащее энтерококки, или высевают навеску продукта, которая указана в нормативно-технической документации на этот продукт.

4.2. Для определения количества энтерококков 0,1 или 0,2 см продукта или его разведения высевают по ГОСТ 26670 на поверхность предварительно подсушенной агаризованной питательной среды, приготовленной по п.3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.9.

4.3. Если необходимо выявить энтерококки в навеске продукта определенной массы или объема, то навеску продукта или его разведение высевают непосредственно в жидкую питательную среду по п.3.2.1 или 3.2.8.

4.4. Посевы инкубируют при (37±1) °С в течение 24-48 ч, через 24 ч проводят предварительный учет результатов, через 48 ч - окончательный.

4.5. После инкубирования посевов, проведенных по п.4.3, учитывают пробирки с признаками роста микроорганизмов: помутнением среды и изменением ее окраски в желтый цвет. Из пробирок с признаками роста, предположительно энтерококков, делают пересевы на поверхность агаризованной среды п.3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.9 таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний, посевы на этих средах инкубируют при (37±1) °С в течение 24-48 ч.

4.6. После инкубирования посевов, проведенных по п.4.2, учитывают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 характерных для энтерококков колоний: