На яично-желточно-азидном и яично-желточно-солевом агаре колонии S. aureus окружены зоной лецитиназной активности.
В посевах по п.7.1.2 отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний, и подсчитывают их.
В посевах по пп.7.2.2 и 7.6 отмечают рост характерных колоний без подсчета их количества.
7.8 Подтверждение принадлежности характерных колоний к S. аureus
7.8.1 Для подтверждения принадлежности характерных колоний к S. aureus отбирают не менее 5 колоний (если при посеве по пп.7.2.2 и 7.6 выросло менее 5 колоний, то отбирают все выросшие колонии) и пересевают на поверхность одной из скошенных питательных сред: мясо-пептонного агара, приготовленного по п.6.2.3, или среды из сухого питательного агара, приготовленного по п.6.2.5.
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.
У выросших микроорганизмов определяют отношение к окраске по Граму, способность коагулировать плазму крови кролика, образовывать каталазу и ферментировать мальтозу в анаэробных условиях.
7.8.2 Окраска по Граму
Из культур, выросших как указано в п.7.8.1, готовят мазки, окрашивают их по Граму (по ГОСТ 30425) и микроскопируют.
S. aureus положительно окрашивается по Граму, имеет шарообразную форму, клетки диаметром 0,6-1,0 мкм, располагающиеся чаще (но не всегда) в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.
7.8.3 Определение каталазы
Способность выросших микроорганизмов образовывать каталазу определяют по ГОСТ 30425. S. aureus образует каталазу.
7.8.4 Определение способности коагулировать плазму крови кролика
Способность коагулировать плазму крови кролика определяют у микроорганизмов, окрашивающихся положительно и образующих каталазу.
К плазме крови кролика, приготовленной и разлитой по пробиркам по п.6.1.7, добавляют по одной петле испытуемых культур, оставляя одну пробирку с разведенной плазмой в качестве контроля незасеянной.
Внесенную культуру тщательно размешивают и помещают в термостат при температуре (36±1) °С. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то пробирки оставляют при температуре (30±1) °С на 24 ч. Если и через 24 ч плазма не скоагулировала, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.
При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).
Реакцию считают положительной, если:
в плазме образовался небольшой компактный сгусток (реакцию оценивают на два плюса);
в плазме образовался большой уплотненный сгусток (реакцию оценивают на три плюса);
плазма вся скоагулировала, сгусток не меняет своего положения при перевертывании пробирки (реакцию оценивают на четыре плюса).
С целью ускорения выявления коагулазоположительных стафилококков вместо суточных культур, выросших на агаризованных средах, допускается применять культуру, выращенную на мясо-пептонном бульоне, и использовать ее для постановки реакции плазмокоагуляции спустя 2 ч после появления видимых признаков роста микроорганизмов. При постановке реакции плазмокоагуляции к 0,5 см разведенной плазмы добавляют две капли суточной бульонной культуры. Учет результатов коагуляции плазмы в данном случае проводят в сроки от 30 мин до 2-4 ч. Оценка степени коагулирования плазмы такая же, как описано выше.
При использовании сухой кроличьей цитратной плазмы руководствуются наставлением по ее применению.
7.8.5 Определение ферментации мальтозы в анаэробных условиях
Способность ферментации мальтозы в анаэробных условиях определяют с целью дифференциации S. aureus от других коагулазоположительных видов S. intermedius и S. hyicus subsp. hyicus.
Для определения ферментации мальтозы в анаэробных условиях культуры, подлежащие исследованию, высевают уколом петлей в среду Гисса с мальтозой, приготовленную по п.6.2.9. На поверхность среды наслаивают голодный агар, приготовленный по ГОСТ 10444.1 п.4.1 высотой 2-2,5 см.
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч.
При ферментации мальтозы в анаэробных условиях с образованием кислоты цвет среды Гисса изменяется.
S. aureus - ферментирует мальтозу в анаэробных условиях, S. intermedius - слабо ферментирует мальтозу в анаэробных условиях, S. hyicus subsp. hyicus - не ферментирует мальтозу в анаэробных условиях.
7.9 Интерпретация результатов подтверждения принадлежности характерных колоний к S. aureus
Если при испытании характерных колоний в них обнаружены грамположительные кокки, способные коагулировать плазму крови, образующие каталазу, ферментирующие мальтозу в анаэробных условиях, то считают, что выявленные микроорганизмы относятся к S. aureus.
7.10 Определение термостабильной нуклеазы
Способность выявленного S. aureus образовывать термостабильную нуклеазу устанавливают при необходимости, для определения его потенциальной энтеротоксигенности.
Для определения термостабильной нуклеазы в среде, приготовленной по п.6.2.6 и разлитой по стерильным чашкам Петри, вырезают асептически колодцы диаметром не более 4 мм, расстояние между колодцами должно быть не менее 7-8 мм. Культуры, выросшие на мясо-пептонном бульоне после инкубирования при температуре (36±1) °С в течение 24 ч, прогревают в кипящей водяной бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и вносят в приготовленные в среде колодцы пастеровской пипеткой по 1-2 капли. Засеянные чашки помещают в термостат при температуре (36±1) °С, результаты учитывают через 1, 2 и 5 ч. При наличии термостабильной нуклеазы появляется ярко розовая зона вокруг колодца на синем фоне среды.
Способность S. aureus образовывать термостабильную нуклеазу подтверждает его энтеротоксигенные свойства.
8 ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
8.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
8.2 Оценка результатов посевов на жидкие среды:
при определении НВЧ S. aureus посевы считают положительными, если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждении характерных колоний, выросших на этих средах, хотя бы в одной колонии будет обнаружен S. aureus. НВЧ S. aureus в 1 г (см ) продукта подсчитывают по количеству положительных посевов по ГОСТ 26670;
при выявлении S. aureus в определенной навеске продукта посевы считают положительными (то есть S. aureus выявлен в анализируемой навеске продукта), если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждении характерных колоний, выросших на этих средах, хотя бы в одной колонии будет обнаружен S. aureus.
8.3 Оценка результатов посевов на агаризованные селективно-диагностические среды:
при выявлении S. aureus в определенной навеске продукта посевы считают положительными, если при подтверждении характерных колоний хотя бы в одной колонии будет обнаружен S. aureus;
при определении количества S. aureus в 1 г/см продукта подсчет числа характерных колоний (см. п.7.7) подлежит корректировке в зависимости от результатов подтверждения принадлежности этих колоний к S. aureus:
если при подтверждении характерных колоний в 80% случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост S. aureus, то считают, что все характерные колонии принадлежат к S. aureus.
В остальных случаях количество характерных колоний (см. п.7.7), принадлежащих к S. aureus, определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения
Пересчет количества S. aureus на 1 г (см ) продукта проводят по ГОСТ 26670.
8.4 Результаты определения количества S. aureus в 1 г (см ) продукта и выявления его в определенной навеске продукта записывают по ГОСТ 26670.
Текст документа сверен по:
официальное издание
Консервы. Методы микробиологического анализа:
Сб. ГОСТов. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2002
